Медицина

Медицина

Применение современного оборудования для 3D печати MakerBot, Stratasys, Concept Laser, 3DCeram и 3d сканирования AGE Solutions в медицине затрагивает самые разные ее отрасли, такие, как:: хирургия, стоматология, сурдология (изготовление коронок, каркасов бюгельных протезов, хирургических шаблонов для имплантации, позвоночных имплантатов, индивидуальных ушных вкладышей для слуховых аппаратов, протезирование конечностей, суставов и т.д.)

Самое широкое распространение 3D принтеры получили в сфере производства индивидуальных протезов различных суставов (тазобедренный, коленный, плечевой), которые изготавливаются на основании данных компьютерной томографии пациента. 3D моделирование протеза ведется в специальной программной среде, которая позволяет получить точную форму изделия с учетом анатомических особенностей пациента.

Другое направление, в котором системы аддитивного производства повышают качество лечения – краниопластика. У врачей появилась возможность изготовить индивидуальную пластину на поврежденный участок черепа из титана напрямую, на основании данных томографии. Помогают в этом установки Concept Laser Mlab R и M2, способные работать с различными сплавами титана. Для производства индивидуальных пластин из керамики используются 3D принтеры 3DCeram Ceramaker

Использование персонифицированных протезов позволяет значительно снизить риск развития осложнений после проведения операции, а также существенно снижает неудобства для пациента, связанные с ношением  протезирующей конструкции.

По всему миру системы аддитивного производства используют в хирургии, для получения индивидуальных медицинских инструментов с учетом требований, выдвигаемых врачом.

Современные 3D принтеры Stratasys позволяют за очень короткий срок сделать индивидуальный слуховой аппарат для пациента, испытывающего проблемы со слухом. Моделирование аппарата идет на основании оцифрованной модели слепка ушной полости. Применяя биосовместимый материал от Stratasys вы сможете всего за пару часов изготовить, индивидуальный слуховой аппарат, отвечающий всем необходимым требованиям. Материалы для сурдологии доступны в нескольких цветах: прозрачный, полупрозрачный, непрозрачный контрастный и материал телесного цвета.

Активные исследования ведутся в области 3D печати структур для выращивания человеческих тканей (кожа, костная ткань, части органов человеческого организма). При помощи 3D-биоплоттера можно создавать четкие матричные 3D структуры из пяти биосовместимых материалов одновременно.

В настоящее время активное применение технологий трехмерной печати идет также в сфере моделирования специальной ортопедической обуви. Системы используются для получения физических моделей подошвы с учетом анатомических особенностей пациента.

3d принтеры MakerBot и Stratasys эффективно применяются для создания прототипов органов, костей и суставов для подготовки врачей и последующего моделирования операций с целью сокращения времени её проведения и снижения рисков для пациента.

3d принтеры Stratasys для медицинского образования3d принтеры Stratasys для медицинского образования3d принтеры Stratasys для медицинского образования

Также 3d принтеры MakerBot успешно применяются для изготовления специализированной оснастки для медицинских лабораторий. Одним из примеров такого применения - лаборатория производства препаратов для лечения артрита компании Pfizer.

Дополнительная информация:

Применение систем 3D печати в медицине:

  1. Планирование операции
  2. Изготовление индивидуальных хирургических инструментов
  3. Изготовление индивидуальных хирургических имплантатов и протезов
  4. Изготовление слуховых аппаратов в сурдологии
  5. Изготовление спинных имплантов
  6. Изготовление ортопедической обуви
  7. Изготовление различных ортопедических и протезирующих конструкций в стоматологии

Био-керамические имплантаты для восстановления обширного и сложного черепно-лицевого дефекта

Авторы: Joël Brie, Thierry Chartier, Christophe Chaput, Cyrille Delage, Benjamin Pradeau, François Caire, Marie-Paule Boncoeur, Jean-Jacques Moreau

Перевод: Трусов П.А., «НИССА Диджиспейс»

Нейрохирургическое отделение, а также отделение челюстно-лицевой хирургии Университета  Клинического Центра г. Лимож разработали новый концепт керамического имплантата из гидроксиапатита (ГА) для реконструкции  больших и сложных дефектов костей черепа (более 25 мм2

Имплантат был произведен с использованием технологи стереолитографии, что позволило получить трехмерный объект на основании скана черепа пациента, без использования формовки и фрезерования. Восемь пациентов получили восемь имплантатов в период с 2005 по 2008 год.

Хирургическая операция была простой  и достаточно быстрой, послеоперационный период составил 12 месяцев. Серьезных  проблем (инфекции или разрушения имплантата) не наблюдалось, косметический результат удовлетворил и пациентов, и хирургов.

Новые имплантаты были успешно использованы для восстановления больших повреждений костей черепа (более 25 мм2) у взрослых и детей старше 8 лет.

Предисловие

Целью нашего исследования было продемонстрировать возможность изготовить индивидуальный имплантат из гидроксиапатита для реконструкции больших повреждений, с хорошими механическими и остеокондуктивными свойствами.

Материалы и методы

Процесс изготовления, использовавшийся при протезировании

В Университете  Клинического Центра г. Лимож был получен скан КТ каждого пациента, с использованием томографа GE Light Speed VAT 64 (150e180, секции 1.25 мм каждые 0.9 мм), от основания черепа к темени, с полем зрения (FOV – field of view) 25 см. Доза рентгеновского излучения, полученного пациентами была в пределах 800-900 мГр/см. Компьютерные данные скана были доставлены в лабораторию 3DCERAM на компакт-диске.

Имплантат был разработан с помощью традиционного конструкторского программного обеспечения на основании файла, полученного с томографа (Рис.1). Имплантат был выполнен пористым для того, чтобы способствовать мягкой адгезии тканей, крепежные отверстия были спроектированы на периферии имплантата. После окончания проектирования, имплантат был виртуально «разрезан» на слои толщиной 100 мкм. 

имплантат на основе данных КТ

Рис.1  Имплантат, разработанный при помощи конструкторского ПО на основе скана КТ для Пациента 5

Имплантат был изготовлен с помощью технологии стереолитографии на 3D принтере 3DCeram Ceramaker, построенной на фото-полимеризации пасты, изготовленной из фотополимерной смолы и порошка гидроксиапатита. Имплантат создавался послойно, с контролем каждого слоя. После того, как печать закончилась, изделие было очищено от неполимеризованной пасты, а полимеризованная смола затем была удалена обжигом, чтобы получить изделие исключительно из гидроксиапатита. Затем, деталь была помещена в печь для спекания при очень высокой температуре, после чего сформировалась окончательная керамическая микроструктура. Такой процесс позволил изготовить имплантат сложной формы за 2-3 недели, без применения механической обработки, с геометрической точностью 0.4 мм

Затем имплантат был упакован в блистер и в упаковке из вспененного полиэтилена был отправлен на стерилизацию. Стерилизация проводилась  гамма-излучением (минимальная доза 25 кГр), в соответствии с нормами NF/EN 556 и NF/EN ISO 11137

Было изготовлено три типа имплантатов. Первые два были полностью плотными, третий – частично с макро порами. При изготовлении первого типа имплантатов были выявлены деформации, вследствие которых имплантат не соответствовал геометрии дефекта. Второй тип, полученный после модификации поддерживающих структур при обжиге, полностью соответствовал дефекту. Чтобы инициировать пролиферацию кости внутри имплантата, в проект третьего типа имплантата были включены макро-пористые зоны (рис. 2). Макро-пористые участки расположены между крепежными отверстиями на глубину около 1 см, размер пор составлял 300 и 550 мкм с шагом 300-500 мкм, что дало плотность пор 50-70%. Для того чтобы не ослабить имплантат во время фиксации, вокруг отверстий была оставлена плотная область 1 см2 (рис. 3).Стоимость изготовления каждого имплантата составила от 8.000 до 10.000 евро.

имплантат с макро-пористыми областями

Рис.2  Имплантат Пациента 2 с макро-пористыми областями, расположенными между крепежными отверстиями на глубину около 1 см

Макро-поры между креплениями имплантата

Рис.3 Макро-поры между крепежными отверстиями

Пациенты и методы

В исследовании участвовали 8 пациентов (2 женщины и 6 мужчин) от 27 до 62 лет, утвержденных местным комитетом по этике, в период с 2005 по 2008 год. Все из них имели обширные дефекты черепно-лицевых костей - от 35 до 109 кв.см. Дефекты были вызваны травмами (6 пациентов) или опухолью (2 пациента).

В связи с двумя изменениями в конструкции имплантата по ходу эксперимента, мы разделили пациентов на три группы: группа I (пациенты 1 и 2 с первым типом имплантата), группа II (пациенты 3 и 4 со вторым типом имплантата), группа III (пациенты 5-8 с третьим типом имплантата)

Пациенты оперировались в нейрохирургическом отделении Университета Клинического Центра г. Лимож в асептических условиях, обычно используемых при этих типах операций. Имплантаты крепились к черепу на нейлоновые нити 2/0, пропущенные через крепежные отверстия, заранее подготовленные на границах имплантата (Рис.4). Выбор метода фиксации был обусловлен желанием не использовать жесткие крепления (ввинчивающихся креплений), которые могли бы быть травматичными, а также желанием не создавать артефакты, которые могли бы повлиять на интерпретацию последующих сканов КТ. Мы измеряли время каждого хирургического вмешательства, а также время, необходимое для установки имплантата. Время установления имплантата складывается из времени, необходимого для размещения и фиксации имплантата. Оно не включает время, необходимое для рассечения кости. Пациенты получали стандартную антибиотикопрофилактику для этого типа операция (Цефазолин: 1 г / сут в течение 48 ч).

установка имплантата пациенту

Рис.4 Имплантат при операции Пациента 5

Переносимость имплантата оценивалась с помощью интервью и клинического обследования пациентов после 1, 6 и 12 месяцев. Интервью сосредотачивалось на четырех критериях (боль, тяжесть, зуд и жжение), измеренных с помощью шкалы EVA. Клиническое обследование исследовало признаки местной и системной инфекции (температура тела, местной температуры, сбор под кожей, выделений из операционной раны). Оно также было направлено на оценку, при пальпации, преемственность между имплантатом и черепа. Целостность имплантатов, их био-интеграция с костями отрастания были оценены с помощью КТ черепа пациента через 1, 6 и 12 месяцев (рис. 5).

Было крайне сложно продемонстрировать проникновение костной ткани в макропористую структуру без гистологического исследования.  Тем не менее, наблюдались интересные проявления на границе кости и имплантата на КТ пациентов с имплантатами с макро-пористыми зонами (пациенты 5, 7 и 8), через 1и 12 месяцев (рис. 6). Были проанализированы 460 зон областей контакта между имплантатами и живой костью. (Пациент 5 – 102 зоны; пациент 7 – 146 зон; пациент 8 – 212 зон), отдельно плотные области (около крепежных отверстий) и макро-пористые участки. Мы зафиксировали ряд областей, где существует частичное или полное слияние имплантатов и окружающих живых костей. Слияние считалось частичным, если оно наблюдалось не по всей высоте зоны соприкосновения.

Эстетические результаты были оценены фотографиями через 1, 6 и 12 месяцев.

Рис.5 КТ скан Пациента 5 через 12 месяцев

Рис.6 Прорастание кости в макро-пористую структуру через 1 и через 12 месяцев у Пациента 7

Результаты

Данные по дефектам костей и времени операции сгруппированы в Таблице1. В ходе различных исследований хирургических ран не наблюдалось никаких признаков воспаления и никакого движения. Размер и форма первых двух имплантатов не была идеально адаптирована к костному дефекту (деформации на стадии спекания), так что был ощутимым небольшой выступ. Тем не менее, это было достаточно маленьким, чтобы не быть заметным на фотографиях. При пальпации места операции у пациентов 3-8 наблюдалась совершенная преемственность между имплантатом и костями черепа, без выступов и без впадин при визуального исследованиях результатов КТ.

Ни у одного из пациентов не было зафиксировано эпизодов гипертермии в период мониторинга. Два пациента жаловались на боли в течение одного месяца после операции, которых не наблюдалось через 6 и 12 месяцев. Один пациент жаловался на зуд, при обследованиях через  1 и 6 месяцев, на обследовании через 12 месяцев зуд исчез. Один пациент жаловался на тяжесть через 1 и 6 месяцев, это чувство тяжести ушло на 12 месяцев. Ни один пациентов не жаловался на чувство жжения. Имплантаты не показали никаких признаков ухудшения при контроле на КТ. Также, ни у кого не наблюдалось мембран инкапсуляции. Результаты исследования на слияние имплантата и кости выполнялось через 1 и 12 месяцев для пациентов 5, 6 и 7, результаты сгруппированы в таблице 3. В макро-пористых областях, где произошло частичное или полное слияние между имплантатом и окружающей костной тканью, кости, казалось, проникли в имплантат (рис. 6). Однако эти результаты основаны на простом визуальном наблюдении результатов КТ. Все пациенты остались удовлетворены косметическим результатом.

фотографии пациента до и после установки имплантата

Таблица 1

Дата пациентов из группы I

Пациент 1

Пациент 2

Возраст пациента к моменту операции

27 лет

54 года

Пол пациента

Муж

Муж

Расположение дефекта

Орбитально-фронтальное

Фронтальное

Размер дефекта

7 * 5 см

9 * 7 см

Время установки имплантата

60 мин

60 мин

Продолжительность операции

180 мин

150 мин

Таблица 2

Данные пациентов из группы II

Пациент 3

Пациент 4

Возраст пациента к моменту операции

38 лет

40 лет

Пол пациента

Муж

Муж

Расположение дефекта

Фронтально- носовое

Фронтальное

Размер дефекта

11.5 * 9.5 см

9 * 7 см

Время установки имплантата

15 мин

30 мин

Продолжительность операции

90 мин

120 мин

Таблица 3

Данные пациентов из группы III

Пациент 5

Пациент 6

Возраст пациента к моменту операции

35 лет

44 года

Пол пациента

Муж

Жен

Расположение дефекта

Височное

Фронтально- носовое

Размер дефекта

11 * 8.5 см

7 * 5.5 см

Макропористые области

62

-

Проникновение в макро-поры

15 (24, 2%)

-

Плотные области

40

-

Проникновение в плотных областях

9 (22, 5%)

-

Итого проникновение

24/102 (23,5%)

-

Время установки имплантата

30 мин

30 мин

Продолжительность операции

105 мин

120 мин

Таблица 3 (2)

Данные пациентов из группы III

Пациент 7

Пациент 8

Возраст пациента к моменту операции

52 года

63 года

Пол пациента

Жен

Муж

Расположение дефекта

Теменное

Височное

Размер дефекта

9 * 8 см

10 * 9 см

Макропористые области

114

117

Проникновение в макро-поры

49 (43%)

21 (17, 9%)

Плотные области

32

95

Проникновение в плотных областях

15 (46, 9%)

28 (29, 6%)

Итого проникновение

64/146 (43,8%)

49/212 (23,1%)

Время установки имплантата

30 мин

30 мин

Продолжительность операции

75 мин

90 мин

Наше исследование продемонстрировало возможность реконструкции обширных дефектов черепно-лицевых костей с помощью индивидуальных керамических имплантатов? изготовленных на 3d принтере 3DCeram Ceramaker, которые показали хорошие механические  и остеокондуктивные свойства. Выбор материала и опций был осуществлен исходя из данных, приведенных в профильной литературе. Из полимеров, наиболее часто используемым является полиметилметакрилат  (PMMA) по причине его низкой стоимости и простоты в использовании. Также в последнее время появились индивидуальные имплантаты из полиэфирэфиркетона (PEEK) (Hanasono et al., 2009). Тем не менее, у нас не было достаточного опыта, чтобы оценить их эффективность. Полимеры считаются заменителями кости первого поколения (Hench and Polak, 2002). Они не демонстрируют остеокондуктивные свойства и вызывают более сильную воспалительную реакцию, ведущую к образованию капсулы и возможному отказу имплантата (Costantino et al., 2000, Chim and Schantz, 2005). Это, возможно, объясняет высокий процент инфекций, зафиксированный в литературе (Velayudhan et al., 2005; Vahtsevanos et al., 2007, Lee et al., 2009).

Титан, благодаря его био-активности, является материалом второго поколения (Hench and Polak, 2002). Большие титановые имплантаты очень массивны (Day et al., 2012). У них нет макропористой архитектуры, что делает их сверх остеокондуктивными. Один из главных недостатков это высокая теплопроводность, которая может раздражать пациента (Spetzger et al., 2010.). Кроме того, они ведут к образованию радиологических артефактов artifacts (D’Urso et al., 2000;  Josan et al., 2005, Lee et al., 2009), что в последствие может вызвать сложности при проведении КТ. Преимущественно, титан используется в форме сетки в комбинации с калций-фосфатным цементом. Тем не менее, процент инфекционных осложнений остается высоким (Spetzger et al., 2010). Лучшими заменителями кости остаются фосфат кальция (керамика или цементы)  из-за их структуры и химического состава очень похожего на минеральную фазу кости (El-Ghannam, 2005; Larsson, 2010). Их биосовместимость и остеокондуктивные свойства широко известны. Однажды был изготовлен индивидуальный имплантат из гидроксиапатита (Staffa et al., 2007, 2012). Это был полностью пористый имплантат, изготовленный формовкой. Этот метод производства не обеспечивает идеальную трехмерную форму, в частности, вдоль краев имплантата - он не имеет тонкие кромки, чтобы позволить живой кости прорастать в него.

В серии Стаффа (Staffa et al., 2012) у 12 пациентов (24%) при пальпации наблюдались контуры имплантата, у одного пациента (2%) присутствовала сильная впадина. Тонкие края имплантата, которые перекрывают границу живой кости, позволяют избежать подобных сложностей (Рис.8). Помимо этого, перекрывание границ кости предотвращает движение имплантата внутрь черепа. Полностью макро-пористая структура имплантата, на наш взгляд, является недостатком. Действительно, распределение макропористых зон в кости очень случайно (White and Shors, 1986, Costantino et al., 1993; Shindo et al., 1993; Verheggen and Merten, 2001). При исследовании имплантата, только 18-43% пористых зон были распределены в костной ткани, что подтверждает данные из литературы. Механическая прочность фосфата кальция керамики уменьшается с увеличением пористости и взаимосвязи пор (Metsger et al., 1999, Puértolas et al., 2011). Таким образом, полностью макро-пористые имплантаты остаются менее устойчивыми, чем плотные имплантаты. Кроме того, чем более пористую структуру имеет имплантат, тем выше риск бактериального заражения (White and Shors, 1986). По этим причинам, мы решили изготавливать имплантат с преимущественно плотной структурой, а с макро-пористой только по краям, для обеспечения лучшей био-интеграции.

При пост-операционных наблюдениях был зафиксировать некоторые зуд, без поражений кожи. Зуд наблюдался в области раны и, вероятно, сопровождал процесс заживления. Мембраны инкапсуляции не наблюдалось. Эти результаты показывают очень хорошую переносимость имплантатов пациентами. Между протезом и костью не было замечено впадин, что показывает идеальную адаптацию протеза к костному дефекту. Это исследование завершится технико-экономическим обоснованием, когда количество пациентов достигнет 30, что должно продемонстрировать, что реконструкция обширного костного дефекта черепа имеет не только эстетический интерес (Stula, 1982; Fodstad et al., 1984; Dujovny et al., 1999, Winkler et al., 2000).

Это исследование показывает, что новые имплантаты из гидроксиапатита хорошо подходят для восстановления больших (больше чем 25 см2) или сложных (передние орбитальные области) черепно-лицевых дефектов костей. Они обладают качествами, которые нет имплантатов, имеющихся в настоящее время на рынке. Однако, пока это предварительные результаты, требующие исследований на большей группе пациентов. С другой стороны, высокая стоимость имплантатов требует соответствующих возможностей у пациентов. Этот метод не следует использовать для восстановления небольших черепно-лицевых костных дефектов. Метод стереолитографии использующийся в данном исследовании, также позволяет изготавливать рассасывающиеся остеокондуктивные био-молекулярные имплантаты третьего поколения.

EnvisionTEC 3D-Bioplotter®

Ниже приведены научные работы, опубликованные пользователями оборудования 3D-Bioplotter. Перечень публикаций не полный; статьи расположены в произвольном порядке. Свяжитесь с нами, если вы не нашли какой-либо статьи или хотите добавить в перечень собственную публикацию. 

Ландерс, Рюдигер, и Рольф, Мюльхаупт «Производство сложных объектов, прототипов и биомедицинских матриц на настольных устройствах с помощью систем САПР и систем построения 3D-структур на базе цифровых моделей из полимеров и реакционноспособных олигомеров». Macromolecular Materials and Engineering 282.1 (2000): 17-21.

Чтобы на базе трехмерных компьютерных моделей получить цельные объекты сложной формы с заданной внутренней структурой, технологии автоматизированного проектирования и обработки изображений дополнили пневматической 3D-системой нанесения одно- и двухкомпонентных составов: термоклеи, растворы, пасты, дисперсии полимеров, мономеров, реакционноспособных олигомеров. В процессе построения 3D-структур отдельные микроточки и микронити располагали так, чтобы готовые сложные объекты, волокна, трубки и матрицы-скаффолды были аналогичны полученным из нетканых материалов. Разрешение порядка 200 мкм зависело от внутреннего диаметра сопла, давления воздуха, скорости построения структуры, реологии и исходного материала. Процесс построения шел в жидкой среде, по плотности сопоставимой с диспергируемыми жидкостями, что снимало необходимость во временных структурах поддержки. Потенциал 3D-построения на основе трехмерных компьютерных моделей продемонстрирован на примере обычной кремнийорганической композиции, отверждаемой влагой воздуха.

Ландерс Р. и др. «Изготовление мягких тканеинженерных матриц с помощью технологий быстрого прототипирования». Journal of Materials Science, 37.15 (2002): 3107-3116.

Матрицы-скаффолды играют важную роль в тканевой инженерии: с их помощью из культивируемых клеток получают живые функционирующие имплантаты. Такие матрицы имеют индивидуальную внешнюю форму и четко выраженную внутреннюю структуру с сообщающимися порами. Проблемы получения прототипов на основе данных САПР-систем хорошо известны в автомобильной промышленности. Для получения компонентов здесь используют технологии быстрого прототипирования (rapid prototyping, RP). Существует ряд решений и для быстрого прототипирования имплантатов из твердых тканей. Для изготовления матриц мягких тканей необходим гидрогель. Пока не существует технологий быстрого прототипирования, позволяющих обработать гидрогель с сохранением его биофункциональных свойств и клеток. Поэтому для производства структур из гидрогеля на настольном оборудовании Центр исследования материалов во Фрайбурге (Германия) разработал новую технологию быстрого прототипирования. Главная особенность технологии — диспергирование жидкостей и паст в трех плоскостях в жидкой среде. Рассчитана пористость матрицы; показан пример преобразования данных из объемной модели в схему построения объекта плоттером. Обсуждаются широкие возможности применения новых матриц из гидрогеля. Особое внимание уделено их потенциалу в тканевой инженерии.

Ландерс, Рюдигер, и др. «Быстрое прототипирование матриц из термообратимых гидрогелей и их оптимизация для тканевой инженерии». Biomaterials 23.23 (2002): 4437-4447.

В 2000 г. Центр исследования материалов во Фрайбурге (Германия) разработал новую технологию быстрого прототипирования для получения матриц-скаффолдов из гидрогеля на настольном оборудовании. Главная особенность технологии — дозированное нанесение жидкостей и паст в трех плоскостях (3D) в жидкой среде. В отличие от традиционных систем быстрого прототипирования, работающих преимущественно по принципу плавления, технология построения объекта на 3D-плоттере путем диспегирования жидких составов в трех плоскостях подходит, в том числе, для тканевой инженерии. Для изготовления матриц можно использовать более широкий спектр синтетических и природных материалов, включая водные растворы и пасты. Впервые по технологии быстрого прототипирования из гидрогеля созданы матрицы заданной формы с четкой внутренней структурой пор. Покрытие поверхности и форма пор улучшили адгезию и рост клеток. Широкий потенциал новых матриц из гидрогеля продемонстрирован на примере клеточной культуры.

2004-2006

Пфистер, Андреас, и др. «Биофункциональное быстрое прототипирование в тканевой инженерии: 3D-биоплоттеры или 3D-печать». Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 42.3 (2004): 624-638.

Два актуальных решения для быстрого прототипирования (3D-принтер и 3D-биоплоттер) сравниваются по возможностям автоматизированного проектирования и производства биодеградируемых полиуретановых матриц-скаффолдов произвольных форм, соответствующих требованиям тканевой инженерии. Использованы алифатические полиуретаны на основе диизоцианата этилового эфира лизина и изофорондиизоцианата. Методом 3D-печати выполнено послойное формирование матриц: закрепление частиц крахмала с последующей инфильтрацией и частичным сшиванием диизоцианата этилового эфира лизина и крахмала. Второй вариант — с технологией 3D Bioplotting — заключался в трехмерном диспергировании и последующей реакции олигоэфиров уретана, полученных из изофорондиизоцианата, олигоэтиленоксида и глицерина. Оценка матриц проводилась методами рентгеновской микротомографии, сканирующей электронной микроскопии и механического тестирования. Пригодность готовых матриц для тканевой инженерии проверяли посадкой на них остеобластоподобных клеток.

Карвальхо, С., и др. «Изготовление мягких и твердых биосовместимых матриц на 3D-биоплоттерах». Virtual Modelling and Rapid Manufacturing-Advanced Research in Virtual and Rapid Prototyping (Виртуальное моделирование и быстрое прототипирование: новейшие исследования). Лондон, Великобритания; Taylor & Francis Group (2005): 97-102.

В тканевой инженерии и реконструкции костей помимо выбора материалов большое значение имеют конструкционные особенности матрицы-скаффолда. Для трехмерных структур можно не только задавать точные химические и механические свойства, но и копировать внешнюю форму нужных костей и хрящей. Новые технологии создания таких 3D-матриц методами быстрого прототипирования пока работают с ограниченным диапазоном материалов. Группа при Центре исследования материалов во Фрайбурге (Германия) разработала новую технологию — 3D BioplottingTM. Для получения 3D-матриц по технологии 3D BioplottingTM подходят практически любые полимеры и биополимеры, включая гидрогели (коллаген, агар и пр.), полимерные расплавы (PLLA, PGA и пр.), а также двухкомпонентные системы (хитозан, фибрин и др.). Опираясь на данные компьютерной томографии пациента, можно быстро изготовить биодеградируемую матрицу по индивидуальному дизайну. Тесты in vitro показали впечатляющие результаты; сейчас идут наблюдения за двумя экспериментами in vivo.

Ли, Цзя Пин, и др. «Производство готовой пористой матрицы из Ti6Al4V методом быстрого прототипирования: подготовка и эксперимент in vitro». Biomaterials 27.8 (2006): 1223-1235.

Технология трехмерной укладки волокна (3D fiber deposition, 3DF), представляющая собой разновидность быстрого прототипирования, успешно применена для получения оригинальных 3D-матриц из Ti6Al4V — с сообщающейся пористой структурой при высоком уровне контроля пористости и размера отдельных пор. Главной особенностью технологии является управляемая компьютером пространственная (3D) укладка волокна Ti6Al4V при комнатной температуре с получением матрицы-скаффолда из выровненных в одном направлении нитей Ti6Al4V. Разработана смесь Ti6Al4V для 3D-укладки волокна, найдены оптимальные параметры трехмерной укладки. Показано влияние этих параметров на структуру пористой матрицы. Подтвержден потенциал предложенной системы быстрого прототипирования 3DF в производстве 3D-матриц Ti6Al4V с регулярной, воспроизводимой архитектурой, соответствующих требованиям тканевой инженерии и ортопедических имплантатов.

Морони, Лоренцо, Дж. Р. де Виджн, С.А. ван Блиттерсвижк. «Тканеинженерные матрицы, изготовленные методом 3D-укладки волокна: влияние геометрии и структуры пор на динамические и механические свойства». Biomaterials 27.7 (2006): 974–985.

Одной из основных проблем тканевой инженерии является получение матриц-скаффолдов, точно имитирующих биомеханические свойства подлежащих регенерации тканей. Традиционные методы производства не позволяют в полной мере контролировать структуру матрицы и моделировать ее механические свойства. Оригинальные технологии производства матриц методом 3D-укладки волокна (3DF) продемонстрировали отличный потенциал в сфере тканевой инженерии. 3D-матрицы воспроизводятся с высокой точностью; характеризуются полностью (100%) сообщающейся структурой с порами разных форм и размеров. Очевидно, что эти особенности влияют и на механические свойства. Рассмотрена взаимосвязь между структурой 3DF-матриц и их динамическими механическими свойствами. Для изменения размеров и формы пор корректировались диаметр и расположение волокон, расстояние между ними и толщина слоев. Динамический механический анализ показал, что увеличение уровня пористости приводит к снижению упругих свойств, включая динамическую жесткость и равновесный модуль, с одновременным повышением параметров вязкости, включая коэффициент демпфирования и остаточную деформацию ползучести. Измерен коэффициент Пуассона с последующим расчетом модуля сдвига. Параметры сжимаемости матриц варьировались между губчатыми и твердыми материалами. Для сравнения протестирован бычий хрящ: его характеристики попали в диапазон полученных матриц. Исследование подтвердило, что вязкоупругие свойства 3DF-матриц можно корректировать с учетом требований к механическим параметрам индивидуальных тканеинженерных конструкций.

Морони, Лоренцо, и др. «Полимерные трехмерные матрицы из пустотелых волокон с контролируемым диаметром полости и толщиной стенок». Biomaterials 27.35 (2006): 5918-5926.

Пустотелые волокна находят применение в самых разных сферах: транспортировка и очистка жидкостей, оптические системы наведения, укрепление композитных конструкций. В тканевой инженерии их используют для управления врастанием тканей и в качестве систем лекарственной доставки. При этом доступные сейчас технологии производства не позволяют одновременно превращать их в трехмерные (3D) матрицы, тем самым расширяя функциональность до более сложных и иерархических структур. Рассмотрена оригинальная технология производства пустотелых волокон с контролируемым диаметром полости и толщиной стенок. Вязкостная инкапсуляция представляет собой реологический феномен, часто осложняющий подачу расплавленных смесей полимеров через узкие трубы, но по этому принципу можно экструдировать волокна с нужной конфигурацией стенок/сердцевины. На втором этапе путем выборочного растворения внутреннего полимера сердцевины получают пустотелые волокна. Диаметр полой сердцевины и толщину стенок контролируют, варьируя входящие в смесь полимеров, структуру смеси и диаметр экструзионного сопла. Полученные экструдаты сразу же упорядочивают в трехмерные матрицы различной конструкции и формы методом трехмерной укладки волокна (3DF). Эту технологию быстрого прототипирования лишь недавно стали применять в производстве тканеинженерных конструкций-скаффолдов. Сформулированы и рассмотрены возможности использования подобных конструкций в тканевой инженерии и контролируемой лекарственной доставке.

Морони, Л., и др. «Динамические механические свойства матриц из PEOT/PBT, полученных методом 3D-укладки волокна: экспериментальный и численный анализ». Journal of Biomedical Materials Research Part A 78.3 (2006): 605-614.

Механические свойства трехмерных (3D) матриц корректируются путем варьирования размеров и форм отдельных пор в структуре с помощью оригинальных производственных методик, среди которых 3D-укладка волокна (3DF). Одним из важных параметров матрицы, имеющих значение для успешной регенерации тканей организма in vivo,выступает динамическая жесткость. Полученные методом динамического механического анализа (ДМА) экспериментальные данные отражают влияние механических и физико-химических свойств используемого материала на динамическую жесткость матрицы, а также пористость и архитектуру конструкции в целом. Целью данного исследования являлась оценка взаимосвязи между вышеупомянутыми параметрами через математическую модель, полученную в ходе эксперимента из механических характеристик. Для иллюстрации того, как механические свойства приближают к заменяемой естественной ткани, замерена динамическая жесткость суставного бычьего хряща и хряща свиного коленного мениска.

Результаты сравнили с динамической жесткостью матриц, полученных по технологии 3DF. Методом динамического механического анализа измерена динамическая жесткость 3DF-матриц из сополимеров поли(этиленоксида терефталата)–поли(бутилена терефталата) (PEOT/PBT). Обнаружено, что при увеличении пористости динамическая жесткость падает в геометрической прогрессии. Влияние архитектуры матрицы (и формы пор), а также молекулярной структуры сополимеров выражено характеристическим коэффициентом α, модулирующим эффект пористости. Данную модель оценивали методом численного моделирования и конечно-элементного анализа экспериментально проверяемых структур. Относительное отклонение между экспериментальной и конечноэлементной моделью не превышало 15% для всех конструкций при динамической жесткости свыше 1 МПа. Следовательно, предложенную математическую модель можно использовать для прогнозирования динамической жесткости пористой матрицы из PEOT/PBT и выбора оптимальной с точки зрения биомеханики структуры для тканеинженерных конструкций.

Рюкер, Мартин, и др. «Ангиогенные и воспалительные реакции на биодеградируемые матрицы в спинных кожных складках мышей». Biomaterials 27.29 (2006): 5027-5038.

От матриц–скаффолдов для тканевой инженерии требуются биосовместимость и стимулирование васкуляризации. Учитывая недостаток информации об этих свойствах, изучены in vivo местные ангиогенные и воспалительные реакции на имплантацию матриц из широко используемых материалов. В спинные кожные складки инбредных мышей BALB/c импланировали пористые матрицы из поли(l-лактида-ко-гликолида) (PLGA) и гидрогеля коллаген-хитозан-гидроксиапатит. Еще часть животных получила изогенный биологический имплантат в качестве кортикального слоя кости. Кожные складки животных без имплантатов выступали в качестве контрольных. После 14 дней методом прижизненной флуоресцентной микроскопии проанализированы ангиогенез, васкуляризация, взаимодействие лейкоцитов и клеток эндотелия, а также капиллярная проходимость. Матрицы из PLGA привели к повышению уровня лейкоцитов по сравнению с контрольной группой. Предполагаемая причина — рост капиллярной проходимости, сравнимый с наблюдавшимся в изогенной костной ткани. Интересно, что материал PLGA вызвал выраженный ангиогенный ответ: плотность вновь образованных капилляров была практически такой же, как у костных имплантатов. Гистология показала проникновение макрофагов, что могло указывать на рассасывание биоматериала. Матрицы из гидрогеля, напротив, вызвали серьезное воспаление, что подтверждалось 15-кратным ростом взаимодействия лейкоцитов и клеток эндотелия и серьезным увеличением капиллярной проходимости. Это объяснялось индукцией погибших апоптических клеток в окружающие ткани и полным отсутствием врастания вновь образуемых микрососудов. Гистология подтвердила адекватное приживление в ткань трансплантата из PLGA и изогенной кости, но не гидрогеля. Матрицы из PLGA демонстрируют лучшую биосовместимость по сравнению со структурами из гидрогеля, стимулируют врастание сосудов, гарантируют адекватное приживление в ткань реципиента.

2007-2009

Ли, Цзя Пин, и др. «Врастание костей в пористые титановые имплантаты, изготовленные методом 3D-укладки волокна». Biomaterials 28.18 (2007): 2810-2820.

Технология 3D-укладки волокна позволяет получать металлические матрицы с точно контролируемым размером пор и соединяющих их каналов, а также уровнем пористости. Это, в свою очередь, дает возможность точнее оценить влияние структурных особенностей на поведение биоматериалов in vivo.

Рассмотрено функционирование in vivo матриц из титанового сплава, изготовленных методом 3D-укладки волокна. Матрицы из титанового сплава с различными структурными свойствами (размер пор и соединяющих их каналов, уровень пористости) имплантировали десяти козам на декортицированные поперечные отростки задней части поясничного отдела. Перед началом имплантации зафиксированы структура и проницаемость имплантатов. Для отслеживания процесса формирования костей во времени на 3, 6 и 9 неделях проконтролированы флюорохромные маркеры; через 12 недель после имплантации животные были умерщвлены. Формирование костей в матрицах проанализировано методами гистологии и гистоморфометрии не-декальцинированных секций с использованием традиционной световой и эпифлуоресцентной микроскопии. Результаты, полученные in vivo, показали увеличение пористости и размера пор, что повысило проницаемость имплантатов из титанового сплава, положительно сказавшись на их остеокондуктивных свойствах.

Ли, ЦзяПин, и др. «Биологическая эффективность пористых композитов из титанового сплава и бифазного кальций фосфата у коз». Biomaterials 28.29 (2007): 4209-4218.

Исследованы пористые имплантаты из титана, полученного методом 3D-укладки волокна (3DFT), и имплантаты из 3DFT, скомбинированного с пористым керамическим бифазным кальций фосфатом (3DFT+BCP). Структуры импланированы внутримышечно и ортотопически десяти козам — в чистом виде и с недельной культурой аутогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BMSC). Для отслеживания процесса формирования костей во времени на 3, 6 и 9 неделях проконтролированы флюорохромные маркеры; через 12 недель после имплантации животные были умерщвлены. Образование костной ткани в матрицах проанализировано методами гистологии и гистоморфометрии не-декальцинированных секций. При внутримышечной имплантации признаков формирования костной ткани не обнаружено ни на одном из 3DFT-имплантатов. Для двух имплантатов BMSC 3DFT зафиксировано очень малое количество костной ткани. Для имплантатов 3DFT+BCP и BMSC 3DFT+BCP отмечено эктопическое формирование костей у 8 и 10 животных, соответственно. Объем сформированной костной ткани был существенно выше для имплантатов BMSC 3DFT+BCP по сравнению с 3DFT+BCP. Имплантация на поперечные отростки привела к значительно более активному формированию костной ткани в композитной структуре по сравнению с чистым титановым сплавом, с клетками и без. В отличие от внутримышечной имплантации, наличие клеток BMSC серьезно не повлияло на количество костной ткани в металлической и композитной структурах. Хотя материал 3DFT по росту костной ткани уступил составу BCP, усиление хрупкого BCP каркасом из титана 3DFT не оказало негативного влияния на остеогенез, остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства, как в случае с чистой BCP-структурой. Позитивный эффект клеток BMSC установлен эктопически; ортотопически выражен незначительно.

Морони, Лоренцо, и др. «Тканеинженерные анатомические матрицы, полученные способом 3D-укладки волокна: проектирование неотрахеи». Tissue Engineering 13.10 (2007): 2483-2493.

Изучено и оценено преимущество матриц-скаффолдов анатомической формы перед цифровыми моделями для формирования хрящей в процессе создания искусственной трахеи. Матрицы изготовлены методом быстрого прототипирования по технологии трехмерной укладки волокна (3DF). Анатомические матрицы, полученные на основе данных компьютерной томографии пациента, сравнивались с цилиндрическими и тороидальными трубчатыми матрицами. 3DF-матрицы заселили хрящевыми клетками трахей, взятыми у крыс линии Lewis, с последующей культивацией в течение 21 дня. Относительное количество сформировавшихся клеток и внеклеточного матрикса (ECM) оценивали по содержанию 3-(4,5-диметилдиазол-2-ил)-2,5 дифенил-тетразолий-бромида (МТТ) и сульфатированного гликозаминогликана (GAG). После трех недель культивирования анатомические матрицы демонстрировали существенное повышение синтеза ECM, а также более высокую степень дифференцировки, что подтвердили замеры соотношения GAG/MTT и сканирующая электронная микроскопия. Интересно, что уменьшение размеров пор и общей пористости матрицы приводило к более активному формированию ткани и лучшей дифференцировке клеток, что подтвердили показатели GAG и GAG/MTT. Матрицы признаны совместимыми, без признаков люминальной обструкции in vitro. Результаты демонстрируют потенциал анатомических матриц в качестве функциональных структур для регенерации тканей. Они не только помогают восстановить оригинальную форму, но и поддерживают формирование более объемных фрагментов ткани.

Вагнер, M., и др. «Сравнительное исследование in vitro пролиферации остеобластоподобных клеток овцы и человека на матрицах, изготовленных традиционным методом и по технологии быстрого прототипирования в качестве потенциального заменителя кости». Journal of Biomedical Materials Research Part A 83.4 (2007): 1154-1164.

Реконструкция костных дефектов остается серьезной проблемой в черепно-челюстно-лицевой хирургии. Регенеративная медицина испытывает недостаток аутогенного костного материала. Налицо потребность в полном отказе от аутогенных костных трансплантатов. Перспективным направлением исследований представляется костная инженерия. Технология быстрого прототипирования открыла новые перспективы в проектировании матриц-скаффолдов. Целью исследования было сравнение матриц, полученных методом быстрого прототипирования (оригинальных и из PLGA с покрытием плазмой) и изготовленных традиционным способом (агаровые пластины с гидроксиапатитом и агаровые пластины с гидроксиапатитом, покрытые гиалуроновой кислотой). Чтобы узнать потенциальные сферы применения полученных 3D-способом матриц в костной инженерии, сравнивались пролиферация, адгезия и морфология остеобластов. Эталонным образцом служил материал TissueFoil E. Для сравнения свойств матриц выбраны культуры остеобластоподобных клеток черепа — 12 человеческих и 12 овечьих. Результаты получены методами EZ4U, сканирующей электронной микроскопии и световой микроскопии. Самая высокая скорость пролиферации человеческих остеобластоподобных клеток зафиксирована для TissueFoil E. Более низкие результаты показали матрицы из PLGA с покрытием плазмой и матрицы из PLGA без покрытия. Для клеток овцы наилучшие результаты отмечены в матрицах из PLGA с покрытием плазмой. За ними — TissueFoil E и матрицы из PLGA. Скорость пролиферации остеобластоподобных клеток человека и овцы на пластинах из агара с покрытием и без покрытия существенно ниже по сравнению с образцом TissueFoil E и матрицами из PLGA. Полученные результаты демонстрируют потенциал быстрого прототипирования в костной инженерии. Необходимо дальнейшее изучение механических свойств таких матриц и исследования in vivo, которые помогут выяснить, в состоянии ли матрицы достаточно долго выдерживать давление в процессе восстановления кости. Требуют дополнительного изучения и вопросы васкуляризации.

Аль-Ахмад, A., и др. «Адгезия бактерий и Candida albicans к 3D-матрицам, полученным по технологии быстрого прототипирования в качестве замены костному материалу». Journal of Biomedical Materials Research Part A 87.4 (2008): 933-943.

В тканевой инженерии, работающей с матрицами-скаффолдами, все большее значение приобретают матрицы, полученные по технологии быстрого прототипирования. На процесс выздоровления и перспективу лечения в целом серьезно влияет закрепление микроорганизмов на поверхности таких конструкций. Важно изучить адгезию микроорганизмов к матрицам, полученным методами быстрого прототипирования. Исследованы матрицы, полученные на 3D-биоплоттере, и адгезия к ним микроорганизмов. Для изучения адгезии дентальных патогенов получены конструкции из трикальций фосфата (TCP), кальция/кремния альгината и поли(лактида-ко-гликолида) (PLGA). Для оценки адгезии выбраны шесть штаммов оральных бактерий, один штамм Candida и человеческая слюна. Определено количество колониеобразующих единиц (CFU), применены сканирующая электронная микроскопия (SEM) и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Микроорганизмы закрепились на всех матрицах. За исключением культуры Streptococcusoralis, наилучшая адгезия отмечена для матриц из PLGA. Адгезия штамма Streptococcusoralis ко всем материалам была одинаковой. Для Streptococcusmutans и Enterococcus faecalis наилучшей была адгезия к матрицам из PLGA, за которыми шли альгинат и TCP. Для Prevotella nigrescens, Porphyromonasgingivalis, Streptococcussanguis и Candida albicans наилучшая адгезия отмечена с матрицами PLGA. Следующие — TCP и альгинат. Для микроорганизмов слюны результат противоположный: наилучшие результаты для TCP, потом — PLGA и альгинат. Результаты сканирующей электронной микроскопии соответствовали результатам определения CFU. При конфокальной лазерной сканирующей микроскопии обнаружены бактерии в более глубоких слоях альгината. Учитывая высокие показатели закрепления оральных патогенов на матрицах, применение этих биоматериалов в качестве заменителей костей в оральной хирургии связано с сопутствующими инфекциями. Идет обсуждение стратегий, направленных на снижение адгезии микроорганизмов с целью предотвращения инфекций.

Эль-Айюби, Рувайда, и др. «Проектирование и производство пористых 3D-матриц в клеточной генной терапии». Tissue Engineering Part A 14.6 (2008): 1037-1048.

Биоматериалы, эффективно доставляющие гены с помощью внедренных в них клеток, могут стать основным инструментом лечения приобретенных и наследственных заболеваний. Основной проблемой остается поддержание нужной диффузии питательных веществ и кислорода в клетках биоматериала. В рамках проекта производство твердого объекта сложной формы скомбинировали с методом выщелачивания порогена, получив трехмерные матрицы для клеточной генной доставки с двумя видами пор. Целью исследования было получение микро-/макропористых матриц, улучшающих жизнеспособность клеток и доставку лекарственных средств. Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (MSC) мышей, которые методами генной инженерии заставили выделять эритропоэтин (EPO), высадили на матрицы из поли-l-лактида (PLLA) с различными показателями микропористости. После двух недель развития культуры зафиксировано увеличение пролиферации и метаболической активности клеток при повышении уровня пористости матрицы. Кроме того, с повышением уровня микропористости возросла концентрация EPO в супернатантах. Исследование показало, что конструкции в состоянии поддерживать жизнеспособность клеток и высвобождение терапевтических белков. Подтверждена их перспективность как объекта двойного назначения: матриц для регенерации ткани и систем доставки растворимых генных продуктов.

Федорович, Наталья Е., и др. «Трехмерная укладка волокна в печати костной ткани с получением жизнеспособных текстурных матриц, заселенных клетками». Tissue Engineering Part A 14.1 (2008): 127-133.

Печать органов и тканей — инновационное направление в тканевой инженерии — основана на послойном формировании насыщенных клетками матриц-скаффолдов из гидрогеля с заданной трехмерной (3D) структурой и упорядоченным расположением клеток. При печати тканей для васкуляризованных костных трансплантатов основное внимание уделяют комбинированию эндотелиальных клеток-предшественников и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BMSC). Описан потенциал технологии 3D-укладки волокна на устройстве Bioplotter в производстве пространственно упорядоченных, заселенных клетками конструкций из гидрогеля. Изучена жизнеспособность отпечатанных клеток BMSC во времени для нескольких вариантов гидрогеля и диаметров экструзионных игл. Наблюдения показали, что клетки выживают после экструзии; их жизнеспособность не хуже, чем у клеток, которые не использовали для печати. Выбранные условия экструзии не влияли на жизнеспособность клеток: клетки BMSC подходили к границе, дифференцируясь вдоль нее в остеобласты. Путем смены печатной насадки в процессе построения структур в одной матрице объединили две отдельные популяции клеток. Это подтверждает, что полученная путем 3D-укладки волокна матрица подходит для создания костных трансплантатов с разными типами клеток.

Йукес, Йоханнеке М., и др. «Важные шаги по созданию тканеинженерного хрящевого имплантата из эмбриональных стволовых клеток». Tissue Engineering Part A 14.1 (2008): 135-147.

Эмбриональные стволовые клетки представляют собой потенциальный источник материала для тканевой инженерии хрящей: это неограниченный запас клеток, которые способны дифференцировать в хондроциты. Пока хондрогенная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши и человека продемонстрирована только на плоских культурах, пробирках, гидрогеле и тонких биоматериалах. Следующей задачей станет формирование хряща на несущей нагрузку матрице естественных размеров in vitro и in vivo для регенерации дефектов у пациентов, страдающих от заболеваний суставных хрящей. Для успешной имплантации клетки высаживают плотно и равномерно по всей матрице. Рассмотрены такие параметры как архитектура матрицы, метод посадки, состояние пор. Посадка клеток на трехмерную матрицу, полученную методом укладки волокна (3DF), идет равномернее, чем на матрицу, изготовленную формовкой под давлением. Эффективной посадке клеток на чистую матрицу помешало отсутствие сыворотки в хондрогенной среде. Для лучшего результата рекомендуется комбинировать клетки с гелем, инжектируя состав в 3DF-матрицы. Жизнеспособность клеток во внутренней части трансплантата оказалась неудовлетворительной. Коэффициент выживаемости выше для клеточных структур, так называемых эмбриоидных тел. Эмбриональные стволовые клетки мышей демонстрировали отличную хондрогенную дифференцировку in vitro — в колбах, на чистых матрицах, в Матригеле, в агарозе (отдельные клетки и эмбриоидные тела). Показано, что необходимо сделать дифференцировку равномернее, исключив образование тератом in vivo. Сделан вывод, что эмбриональные стволовые клетки подходят в качестве источника клеток для тканевой инженерии хрящей при условии дальнейшей оптимизации технологии.

Кирякиду, К., и др. «Динамическая совместная посадка остеобластов и эндотелиальных клеток на 3D-матрицы из поликапролактона в передовой инженерии костной ткани». Journal of Bioactive and Compatible Polymers 23.3 (2008): 227-243.

Матрицы-скаффолды для тканевой инженерии должны иметь упорядоченную и воспроизводимую микроструктуру: только в этом случае клетки будут сгруппированы в матрикс, обеспечивающий адекватное распределение питательных веществ. Для оценки взаимодействия эндотелиальных и остеобластоподобных клеток на пористую 3D-матрицу заданной формы из поли(ε-капролактона) (PCL) одновременно высажены остеобластоподобные клетки человека (MG63) и эндотелиальные клетки аллантоисной вены человека (HUVEC), которые культивировали в ротационной системе (RCCS-4DQ). Отсутствие существенного повышения активности остеобластов ALP и производства ECM в динамической системе культур означает, что микрогравитационные параметры ротационной системы воздействовали на клетки, улучшая пролиферацию и межклеточные связи. Результаты демонстрируют, что под влиянием остеобластов повышается пролиферация эндотелиальных клеток. В свою очередь, эндотелиальные клетки активизируют рост остеобластов, но снижают уровень их дифференцировки. Динамическое высаживание остеобластов и эндотелиальных клеток на полимерную 3D-матрицу представляет собой особый подход к изучению механизмов взаимодействия эндотелиальных клеток и остеобластов, а также к получению функционального гибрида, в котором ангиогенез, подготовленный неоваскулярной структурой эндотелиальных клеток, дополнительно способствует росту остеобластов. Предложенная модель in vitro может быть полезна для изучения актуальности материалов с оригинальной структурой в тканевой инженерии.

Лашке, Маттиас В., и др. «Оптимизация васкуляризации матриц из PLGA путем анастомоза предварительно сформированных in situ функциональных кровеносных сосудов с микроциркуляторной системой реципиента». Annals of surgery 248.6 (2008): 939-948.

Цель. Проанализировать in vivo потенциальное ускорение формирования кровеносной системы в имплантированных матрицах путем анастомоза предварительно сформированной in situ капиллярной системы с микроциркуляторной системой реципиента.

Дано. Для выживания трансплантированных тканевых конструкций на базе матриц-скаффолдов критична быстрая васкуляризация.

Методы. Матрицы из полилактида-ко-гликолида имплантировали в боковую часть мышей линии balb/c и трансгенных мышей с зеленым флуоресцентным белком (GFP) на 20 дней для формирования новой капиллярной системы in situ. После этого предварительно васкуляризованные матрицы перенесли в спинные кожные складки изогенных мышей-реципиентов. Контрольной группой служили матрицы из полилактида-ко-гликолида без предварительной васкуляризации. Через 14 дней методами флуоресцентной микроскопии, гистологии и иммуногистохимии проанализированы васкуляризация, перфузия крови и выживание клеток в имплантатах.

Результаты. Показано существенное ускорение и улучшение перфузии крови для предварительно васкуляризированных матриц (136,7 ± 23,2 пл/с) по сравнению с контрольной группой (6,9 ± 1,9 пл/с. Предварительно сформированные in situ микрокапилляры реперфузировали путем формирования внутренних связей с микроциркуляторной частью реципиента. Апоптическая смерть клеток в имплантатах, вызванная недостаточной перфузией крови, зафиксирована только в течение первых 3–6 дней после имплантации матрицы; не отмечалась в течение остального периода 14-дневных наблюдений.

Выводы: Анастомоз предварительно сформированных in situ функциональных кровеносных сосудов представляет собой перспективный подход к улучшению кровоснабжения имплантируемых тканеинженерных конструкций.

Лашке, М. В., и др. «Инкорпорация Матригеля с фактором роста для стимулирования васкуляризации пористых матриц из PLGA». Journal of Biomedical Materials Research Part A 85.2 (2008): 397-407.

Быстрая интеграция кровеносных сосудов в матрицы-скаффолды является одним из главных условий выживания трехмерных тканеинженерных конструкций. Проанализировано, насколько добавление Матригеля ускоряет васкуляризацию имплантированных матриц из поли-D,L-лактида-ко-гликолида (PLGA). На пробах аортального кольца исследованы проангиогенные свойства Матригеля с пониженным содержанием факторов роста (GFRM) и с факторами роста (GFCM). Затем Матригель добавили в поры матриц из PLGA. Через 14 дней после имплантации в спинные кожные складки мышей balb/c методами прижизненной микроскопии, гистологии и иммуногистохимии проанализированы васкуляризация, биосовместимость и интеграция матриц. Контрольной группой служили матрицы без Матригеля. В пробе аортального кольца среда GFRM стимулировала образование трубчатых сосудистых структур; по сравнению с группой GFRM существенно выросла площадь и плотность отростков. Среда GFRM ускорила и улучшила интеграцию новых кровеносных сосудов в матрицы in vivo, способствовав формированию покрытой перицитами сосудистой сетки с повышенной, по сравнению с GFRM и контрольной группой, функциональной плотностью капилляров. Анализ взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток в венулах ткани реципиента, расположенных в непосредственной близости от матриц, не выявил значительной разницы в количестве свободных и закрепленных лейкоцитов между наблюдаемыми группами. Очевидно, что добавление Матригеля не повлияло на биосовместимость матриц из PLGA. Комбинирование проангиогенных внеклеточных матриксов и твердых биоматериалов для матриц может стать новым подходом к ускорению васкуляризации тканеинженерных конструкций.

Морони, Лоренцо, и др. «Матрицы, полученные методом 3D-укладки и электростатического формования волокна, способствуют образованию хрящевой ткани». Advanced Functional Materials 18.1 (2008): 53-60.

Для полученных методом быстрого прототипирования матриц-скаффолдов характерна упорядоченная и полностью сообщающаяся структура пор, но решающим фактором для успешной регенерации тканей остается эффективное высаживание клеток. Связано это, в первую очередь, с актуальными ограничениями по размеру пор. Описаны оригинальные трехмерные (3D) матрицы, изготовленные по комбинированной методике трехмерной укладки волокна (3DF) и электроформования волокон (ESP). В состав матриц входили упорядоченное микроволокно 3DF и неупорядоченное волокно ESP (3DFESP). Матрицы 3DF придают конструкции целостность и механические свойства; структура ESP служит системой «фильтрации» и захвата клеток, а также доставки лекарственных средств на уровень внеклеточного матрикса (ECM). Чтобы оценить влияние интегрированных структур из ESP на захват клеток и формирование хрящевой ткани, первичные суставные хондроциты быка изолировали, высадили на матрицы 3DF и 3DFESP и культивировали в течение четырех недель. Матрицы 3DFESP демонстрировали более качественный захват клеток по сравнению с матрицами 3DF. Кроме того, после 28 дней наблюдалось повышенное содержание ECM (выраженного в сульфатированных гликозаминогликанах, ГАГ) при существенном росте соотношения ГАГ/ДНК. SEM-анализ матриц 3DFESP показал округленную морфологию клеток. В матрицах 3DF морфология была плоской, демонстрируя, что размер волокон напрямую влияет на дифференцировку клеток. На морфологию клеток также повлияла поверхностная топология ESP. Интеграция технологий 3DF и ESP дает новый вариант «умных» матриц для тканевой инженерии.

Рюкер, Мартин, и др. «Васкуляризация и биосовместимость матриц из составов на основе фосфата кальция». Journal of Biomedical Materials Research Part A 86.4 (2008): 1002-1011.

Матрицы-скаффолды для тканевой инженерии костей должны, с одной стороны, имитировать костный матрикс, с другой — стимулировать врастание кровеносных сосудов. До сих пор не изучалось, соответствуют ли этим требованиям такие материалы на основе фосфата кальция, как синтетический гидроксиапатит и бесклеточный дентин. Ангиогенные и воспалительные реакции организма реципиента на эти биоматериалы проанализированы in vivo. В спинные кожные складки инбредных мышей линии balb/c импланировали пористые матрицы из гидроксиапатита и изогенного бесклеточного дентина. Еще одна группа животных получила перфорированные имплантаты изогенной черепной кости, которая по размерам и структуре пор соответствовала обеим матрицам. В качестве контрольных использовались складки животных без имплантатов. После 14 дней методом прижизненной флуоресцентной микроскопии проанализированы ангиогенез, васкуляризация, а также воспалительное взаимодействие лейкоцитов и клеток эндотелия и капиллярная проходимость. Имплантация матриц из гидроксиапатита и дентина привела к некоторому повышению уровня лейкоцитов по сравнению с контрольной группой. Предполагаемая причина — рост капиллярной проходимости, сравнимый с наблюдавшимся в реакции на изогенную костную ткань. И гидроксиапатит, и дентин в матрицах стимулировали выраженную ангиогенную реакцию: к 14 дню васкуляризация имплантатов была завершена. Интересно, что в матрицах из гидроксиапатита вновь образованные капилляры расположены не так плотно, как в матрицах из дентина. Последние по функциональной плотности капилляров сопоставимы с имплантатами из кости. Матрицы из гидроксиапатита и, в первую очередь, дентина способствуют васкуляризации и по биосовместимости сравнимы с изогенной костью. Это повышает вероятность быстрой интеграции данных материалов в ткань реципиента.

Йилгор, Пинар, и др. «Полученные на 3D-плоттере матрицы из PCL в тканеинженерных конструкциях со стволовыми клетками». Macromolecular Symposia. Vol. 269. No. 1. WILEY‐VCH Verlag, 2008.

Чтобы обеспечить совместимость матрицы-скаффолда и ткани реципиента, важно контролировать архитектуру и прочность матриц для тканевой инженерии костей. Используемая в тканевой инженерии технология быстрого прототипирования (rapid prototyping, RP) призвана решить эти проблемы, обеспечив получение матрицы по сканированному и оцифрованному изображению дефектного участка. С ее помощью можно разрабатывать и производить сложные структуры различных форм и размеров — микро и макро — с полностью сообщающейся системой пор и нужными механическими свойствами. По технологии RP получены матрицы из поли(ε-капролактона) (PCL). При сохранении типовой архитектуры подготовлены четыре конфигурации матриц, отличающиеся расположением волокон (основное, основное со смещением, перекрестное, перекрестное со смещением). Структуру готовых матриц исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (SEM), пористость и распределение пор — методом микрокомпьютерной томографии (μ-CT), жесткость и модульные значения — методами динамического механического анализа (ДМА). Отмечено, что матрицы имеют четко упорядоченную структуру с пористостью около 60% и модулем накопления порядка 1 × 107 Па. Чтобы изучить взаимосвязь между структурой матрицы и поведением клеток, матрицы заселили мезенхимальными стволовыми клетками (MSC) костного мозга крысы; оценивались пролиферация и дифференцировка клеток на матрицах. Пролиферация клеток выше на матрицах со смещением (262000 и 235000 для основной, 287000 и 222000 для перекрестной структуры). Метод окраски актиновых волокон клеток показал успешное прикрепление и распространение по площади волокон. Как и ожидалось, активность щелочной фосфатазы (ALP) выше для образцов с замедленной пролиферацией клеток. Наиболее высокая дифференцировка клеток MSC отмечена для матриц с перекрестной структурой, что подтверждает влияние структуры на активность клеток.

Эль-Айюби, Рувайда, и др. «Проектирование и динамическое культивирование 3D-матриц в инженерии хрящевых тканей». Journal of Biomaterials Applications (2009).

При разработке тканеинженерных матриц важно, чтобы по твердости и прочности они соответствовали здоровым тканям, сохраняя при этом сообщающуюся структуру пор и достаточную пористость. Методом 3D-построения получены поли-L-лактидные (PLLA) макропористые матрицы с порами двух разных размеров. Способность полученных макропористых матриц поддерживать прикрепление и жизнеспособность хондроцитов сравнили в условиях статических и динамических нагрузок in vitro. Кроме того, комбинированием технологий 3D-построения и выщелачивания порогена получены микро/макропористостые матрицы, что позволило исследовать эффект микропористости на уровне сцепления и жизнеспособности клеток при сходных нагрузках. Хондроциты собаки высадили на матрицы с различной топологией и культивировали структуры в течение двух недель в статичных условиях и в биореакторе при динамических компрессионных нагрузках в 10% с частотой 1 Гц. Прикрепление и рост хондроцитов исследовали методами сканирующей электронной микроскопии (SEM) и пробой MTT. После одного, 7 и 14 дней зафиксирована существенная разница в закреплении клеток на матрицах с разным размером пор. Жизнеспособность клеток в матрицах на протяжении периода культивирования была выше для пор меньшего размера и более высокой микропористости. Жизнеспособность хондроцитов, культивируемых в матрицах при динамических нагрузках, была намного выше (p<0,05), чем при статичном культивировании. Динамическое культивирование клеток в матрицах повышало их жизнеспособность и ускоряло культивирование in vitro по сравнению с структурами, культивируемыми статично. Подбор условий развития культуры и свойств самой матрицы даст оптимальные комбинации из тканей/конструкций для восстановления хрящей.

Федорович, Наталья Е., и др. «Фотосшиваемый гидрогель Лутрол в печати тканей». Biomacromolecules 10.7 (2009): 1689-1696.

Применение гидрогелей в тканевой инженерии и инновационных технологиях, включая печать органов путем послойного 3D-формирования заселенных клетками гидрогелей, требует создания для них оригинальных матриксов. Требования к гидрогелю для 3D-печати: 1) сохранение отпечатанной формы после нанесения; 2) поддержание жизнеспособности и функционирования клеток, 3) простота отпечатанной конструкции в обращении. Проанализирован потенциал инновационного гидрогеля (Лутрол) в печати объемных (3D) структурных трансплантатов костей. Термочувствительный гидрогель Lutrol-F127 быстрее застывает, реагируя на температуру, что удобно для формирования объектов методом 3D-экструзии. Дополнительная стабильность за счет ковалентного фотосшивания упрощает обращение с готовыми матрицами. Изучена цитотоксичность гидрогеля и остеогенная дифференцировка внедренных остеогенных клеток-предшественников. После фотополимеризации модифицированного гидрогеля Лутрол клетки до трех недель сохраняли жизнеспособность и способность к дифференцировке. Инкапсуляция клеток не оказала негативного влияния на механические свойства полученных гелей, позволив успешно отпечатать многослойные пористые структуры из Лутрола.

Ли, Чанг Х., и др. «Формирование тканей и васкуляризация в эктопическом суставном мыщелке человека анатомической формы in vivo». Tissue Engineering Part A 15.12 (2009): 3923-3930.

Одной из проблем регенеративной медицины остается доведение полученных методами биоинженерии трансплантатов до клинического использования. Рассмотрено формирование тканей и васкуляризация эктопических большеберцовых мыщелков анатомической формы размерами 20 × 15 × 15 мм3. На композит с сообщающимися микроканалами (400 мкм), изготовленный путем послойного осаждения трехмерных чередующихся нитей поли-ɛ-капролактона и гидроксиапатита, высажены мезенхимальные стромальные клетки человеческой кости (hMSC) с остеогенной дифференцировкой и без. Поверхностному слою гидрогеля на основе поли(этилен гликоля) глубиной 1 мм с инкапсулированными клетками hMSCs и производными от клеток hMSC хондроцитами формовкой придали анатомическую форму и закрепили в микроканалах методом инфузии геля. После 6 недель подкожной имплантации у атимических крыс клетки hMSC дали значительно больше кровеносных сосудов. Более того, эти сосуды намного крупнее в диаметре по сравнению с остеобластами из клеток hMSC, хотя у последних в микроканалах присутствовала минерализованная ткань. Хондроциты в матриксе (сафранин О-позитивный гликозаминогликан) представлены в хрящевом слое, заселенном хондроцитовыми клетками, произошедшими из hMSC. Значительно больше клеток находилось в хрящевом слое, заселенном hMSC, а не полученными из hMSC хондроцитами. Вместе мезенхимальные стромальные клетки (MSC) гораздо активнее стимулируют ангиогенез, а их потомство соответствует дифференцированным фенотипам тканей. Для улучшения результатов целесообразно включать в воспроизводимые модули внутренних микроканалов комбинацию из стволовых клеток и их потомства.

Мейхер, П. С., и др. «Создание биологических 3D-матриц по технологии быстрого прототипирования». Rapid Prototyping Journal 15.3 (2009): 204-210.

Задача. Для создания тканеинженерных матриц, призванных заменять или восстанавливать поврежденную ткань, сложно использовать гидрогели с низкой вязкостью: из-за длительного застывания матрица оказывается нестабильной и разрушается. Однако последние разработки в сфере быстрого прототипирования привели к созданию новой технологии «биопостроения» (bioplotting), призванной решить эти проблемы. Рассмотрены технические подробности процесса.

План/методология/подход. Продемонстрировано, как с помощью технологии биопостроения получать трехмерные (3D) биологические матрицы-скаффолды сложных форм — с точными размерами и четко очерченными порами. Из гелей PEG, содержащих закрепляющиеся на клетках пептидные RGD-цепи, послойно формировали направленные микроканалы с функциональной биоактивной поверхностью. Заселение гелей миобластами C2C12 показало, что клетки реагировали на топографические свойства и самовыравнивались вдоль каналов.

Выводы. Данная технология позволяет выстраивать структуры из различных материалов в емкости, заполненной средой со сходными реологическими свойствами. Среда поддерживает структуру в процессе диспергирования и инициирует образование поперечных связей в гидрогеле. Контролируя концентрацию, вязкость и температуру обрабатываемого материала и среды для построения, можно ускорить застывание гидрогеля и образование поперечных связей в емкости с рабочей средой. Получены тканеинженерные матрицы из различных материалов: поли (этиленгликоль) (PEG), желатин, альгиновая кислота и агароза с различными параметрами концентрации и вязкости.

Сильва, Нуно А., и др. «Разработка и описание оригинальной гибридной тканеинженерной матрицы для восстановления травмированного спинного мозга». Tissue Engineering Part A 16.1 (2009): 45-54.

Травма спинного мозга (ТСМ) — важная медицинская и социальная проблема, требующая новых подходов к ее решению. Разработан новый спектр трехмерных (3D) трубчатых структур, призванных стимулировать регенерацию в участках ТСМ. На первом этапе методом быстрого прототипирования получено до шести различных объемных трубчатых структур: на 3D-биоплоттере из биодеградируемой крахмальной смеси. Центральную часть структур заполнили гидрогелем Gellan Gum на основе полисахаридов. Методом динамического механического анализа (ДМА) замерены механические свойства полученных структур в сухом и сыром виде. Их морфологию/пористость оценили методами микрокомпьютерной томографии и сканирующей электронной микроскопии. Кроме того, путем биологической оценки определена их цитотоксичность: экстракцией минимальной среды Игла (MEM) и тестами MTS, а также инкапсуляцией олигодендроцитоподобных клеток (линия клеток M03-13) в фазе гидрогеля. Гистоморфометрический анализ показал структуру из полностью сообщающихся пор при уровне пористости от 70 до 85%. Модуль объемного сжатия представленных матриц варьировался в диапазоне от 17,4 до 62,0 МПа и от 4,42 до 27,4 МПа в сухих и влажных условиях, соответственно. Проба показала отсутствие цитотоксичности у гибридных матриц из крахмала/поли-ɛ-капролактона/геля Gellan Gum: они не оказали заметного влияния на морфологию клеток, их пролиферацию и метаболизм. Предварительный тесты с инкапсулированием клеток подтвердили, что гибридные матрицы способны поддерживать культуру олигодендроцитоподобных клеток in vitro. Два предварительных исследования in vivo, проведенных на модели ТСМ у крыс после гемисекции, показали хорошую интеграцию вышеупомянутых структур в травмированный участок, без хронических воспалительных процессов. Результаты свидетельствуют, что такие 3D-структуры могут быть полезны для перспективных методик регенерации ТСМ.

Тан, Цян, и др. «Постоянное перемещение среды внутри матрицы с посадкой и культивированием хондроцитов при создании тканеинженерной трахеи». Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery 8.1 (2009): 27-30.

Исследована возможность посадки хондроцитов в матрицу из поли (этиленгликоля)–телефталата–поли (бутилен терефталата) PEOT/PBT путем перемещения через матрицу жидкой среды, а также влияние этого перемещения на культуру хондроцитов в матрице. Восемь кубических единиц сополимеров PEOT/PBT (1 см3) разделили на две группы. В группе с полудинамическим высеванием постоянное перемещение среды внутри матрицы поддерживала насосная система. В течение пяти дней в матрицу ежедневно доставлялось около 6 млн. хондроцитов, взвешенных в 1 мл среды. Контрольными служили группы с прямой посадкой хондроцитов и статическим культивированием. Оценка распределения хондроцитов внутри матриц проводилась методами сканирующей электронной микроскопии (SEM) и гистологии. Жизнеспособность клеток проверялась с помощью теста MTT. Изображения SEM и гистологические срезы в группе с жидкой средой показали лучший пространственный рост клеток и обширное распределение клеток внутри матрицы. В контрольной группе хондроциты выборочно образовали монослой на поверхности матрицы. Соответственно, результаты MTT в группе с потоком жидкости были намного выше, чем в контрольной (0,123 вместо 0,067, P<0,01). Постоянное перемещение среды внутри матриц из PEOT/PBT эффективно объединяет посадку хондроцитов и культивирование клеток при создании тканеинженерной трахеи.

Вудфилд, Т., и др. «Инженерия хрящевых тканей с применением автоматизированного проектирования матриц и передовых технологий биопроизводства». Journal of Bone & Joint Surgery, British Volume 91.SUPP II (2009): 343-343.

Способность суставного хряща к регенерации ограничена. Серьезной проблемой для тканевой инженерии по-прежнему остаются методики заселения и дифференцировки отдельных хондроцитов на пористых 3D матрицах-скаффолдах актуальных для медицины размеров. Хорошо изученным методом получения небольших образцов дифференцированной хрящевой ткани in vitro является микромассовая культура (гранулы): из хондроцитов в высокой концентрации получают круглую гранулу ткани. При этом клинического применения культуры в гранулах пока не нашли, поскольку объем ткани на выходе составляет всего 1–2 мм. Целью исследования было разработать метод массового производства таких гранул и понять, реален ли альтернативный метод «посадки гранул» с фиксацией в нужных точках большого количества круглых гранул за счет особой конструкции 3D-матриц.

2010-2012

Бат, Эрхан, и др. «Сшивание ультрафиолетовым излучением поли (триметилен карбоната) для получения тканеинженерных эластомерных матриц». Biomaterials 31.33 (2010): 8696-8705.

Рассмотрен практический метод образования поперечных связей в поли (триметилен карбонате) (PTMC) с большой молекулярной массой. Путем УФ-облучения пленок PTMC с содержанием пентаэритритол триакрилата (PETA) и фотоинциатора можно легко получать гибкие, эластичные, биодеградируемые структуры. Изучены параметры таких структур из фотосшитых пленок PTMC, механические свойства, смачивамость и ферментная эрозия in vitro. Описанный подход дает плотно сшитые структуры с содержанием геля до 98%. Путем фотосшивания получены гибкие и прочные структуры с отличными эластомерными свойствами. Для демонстрации легкости, с которой корректируются параметры таких структур, выполнено сшивание смесей PTMC и mPEG-PTMC либо PTMC-PCL-PTMC. Смешивание с блок-сополимерами дает возможность регулировать смачиваемость и скорость ферментной эрозии таких структур. С помощью гибких фотосшиваемых материалов также получены тканеинженерные матрицы-скаффолды. После образования поперечных связей в готовых матрицах на основе PTMC подтверждено наличие сообщающихся пор и обширной микропористости. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSC) показало, что фотосшитые матрицы из PTMC и композиций PTMC/PTMC-PCL-PTMC хорошо подходят для задач тканевой инженерии.

Хаберстро, Картин, и др. «Восстановление костей с помощью заселенных клетками композитных 3D-матриц, полученных на биоплоттере из обработанного коллагеном трикальций фосфата, гидрогеля трикальций фосфат-хитозан-коллаген или PLGA, при тяжелых травмах свода черепа у овец». Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 93.2 (2010): 520-530.

Исследован остеогенный эффект трех видов заселенных клетками 3D-матриц, полученных на биоплоттере, на модели тяжелых травм свода черепа у овец. При выборе материалов для матриц учитывалась их совместимость с 3D-биоплоттерами и возможность получения конструкций с заданными параметрами для замены фрагментов костей сложных форм в черепно-лицевой хирургии. Известно, что остеоиндуктивные свойства имеют матрицы-скаффолды, выполненные из заселенного клетками поли(L-лактид-сo-гликолида) (PLGA) либо содержащие компоненты с остеоиндуктивными свойствами (трикальций фосфат/TCP, коллаген/Col, хитозан). На материалы для матриц — PLGA, TCP/Col и HYDR (TCP/Col/хитозан) — высажены остеобластоподобные клетки из костей (OLB) и надкостницы (OLP). Девять овец прошли остеотомию, получив тяжелые травмы черепа предсказуемого и рандомизированного характера. Были сформированы группы по три животных для матриц HYDR, TCP/Col и PLGA. На один дефект у каждого животного приходился один вид матрицы: без клеток, с клетками OLB или OLP. В качестве контрольного выступал четвертый необработанный дефект. После 14 недель животных усыпили для гистоморфометрического анализа восстановления дефекта. В матрицах HYDR с клетками OLB и OLP и матрицах TCP/Col с клетками OLB зафиксирован большой объем новообразованной кости в нижней части дефекта, для матрицы HYDR с клетками OLP — в области матрицы. Матрицы из PLGA показали более низкие результаты. Относительная плотность новообразованной кости была существенно выше в группе HYDR/OLB по сравнению с соответствующей группой PLGA. Жесткость материала TCP/Col позволяет использовать его для получения на биоплоттере сложных конструкций, но материалы HYDR и PLGA были слишком мягкими. Материал HYDR продемонстрировал нормальный уровень биодеградации. Материалы TCP/Col и PLGA после 14 недель практически не имели признаков разрушения. Полученные на 3D-биоплоттере матрицы из HYDR и TCP/Col, заселенные клетками, повышают объем новообразованной кости при тяжелых травмах черепа у овец. Но по жесткости и, соответственно, уровню биодеградации, они не подходят для черепно-лицевой хирургии. Необходима дальнейшая доработка путем внесения изменений в производственный процесс либо состав.

Ким, K., и др. «Регенерация зубов и околозубных тканей с сохранением анатомической формы с помощью клеточного хоуминга». Journal of Dental Research 89.8 (2010): 842-847.

При регенерации зубов путем доставки клеток возникают проблемы трансляции. Выдвинута идея, что анатомически правильный зуб способен регенерировать в матрице-скаффолде без трансплантации клеток. По технологии 3D-биопечати изготовлены оригинальные матрицы в форме человеческого моляра и крысиного резца. Материал — гибрид поли-ε-капролактона и гидроксиапатита с сообщающимися порами диаметром 200 мкм. Каждой из 22 крыс после удаления мандибулярного резца ортотопически имплантировали аналогичную матрицу. Матрицу человеческого моляра эктопически имплантировали в спину. Микроканалы матриц заполнили смесью белковых факторов хоуминга SDF-1 (stromal-derived factor-1) и BMP-7 (bone morphogenetic protein-7). Через 9 недель ткань, напоминавшая периодонтальную связку, и новая кость регенерировали на поверхности матрицы-резца с нативной альвеолярной костью. Доставка факторов SDF1 и BMP7 не только стимулировала более активное привлечение эндогенных клеток, но и существенно улучшила ангиогенез в сравнении с контрольными матрицами без факторов роста. Регенерация зубоподобных тканей и интеграция периодонта с помощью клеточного хоуминга выступают альтернативой доставке клеток и могут ускорить решение клинических задач.

Ли, Чанг Х., и др. «Регенерация артикулярной поверхности синовиального сустава кролика с помощью клеточного хоуминга: проверка обоснованности концепции». The Lancet 376.9739 (2010): 440-448.

Введение: Общепринятым способом регенерации тканей является доставка клеток, в том числе путем прямой трансплантации стволовых клеток и клеток-предшественников. Альтернативный способ — привлечение эндогенных клеток — требует экспериментального подтверждения. Проверено предположение о том, что артикулярная поверхность синовиального сустава регенерирует под воздействием биологических стимуляторов, внедренных в биоматрицу анатомически правильной формы.

Методы: Для проверки обоснованности концепции лазерным сканированием зафиксирована поверхностная морфология проксимального плечевого сустава и воспроизведена методом автоматизированного проектирования. Из поли-ε-капролактона и гидроксиапатита изготовлена биоматрица анатомически правильной формы. Хирургическим способом полностью удалили артикулярную поверхность односторонних проксимальных синовиальных мыщелков у кроликов с сформированным скелетом и заменили биоматрицами, которые наполнены гидрогелем коллагена, адсорбировавшим трансформирующий фактор роста β3 (TGFβ3) и без фактора TGFβ3. Через 1–2, 3–4 и 5–8 недель после хирургического вмешательства оценивались локомоция и устойчивость к нагрузкам. Через 4 месяца регенерировавшие образцы хрящей извлекли in vivo для оценки трещин на поверхности, толщины, плотности, количества хондроцитов, коллагена типа II и аггрекана, а также механических свойств.

Выводы: Десять кроликов получили биоматрицы с фактором TGFβ3, десять — биоматрицы без фактора TGFβ3. Трем кроликам удалили суставную головку без последующей замены на биоматрицу. Все животные в группе с фактором роста TGFβ3 полностью восстановили локомоцию и устойчивость к нагрузкам через 3–4 недели после хирургического вмешательства, стабильнее, чем в группе, не получившей фактор роста TGFβ3. Кролики, получившие травму без имплантации матрицы, постоянно хромали. Через 4 месяца после операции артикулярная поверхностью биоматриц с добавлением TGFβ3 была полностью покрыта гиалиновым хрящом. Для биоматриц без TGFβ3 зафиксированы отдельные участки формирующейся хрящевой ткани. У кроликов без матриц образования хряща не отмечено. Присутствие фактора TGFβ3 способствовало равномерному распределению хондроцитов в матриксе с коллагеном типа II и аггреканом, а также существенно увеличило толщину (p=0·044) и плотность (p<0·0001) по сравнению с хрящами, формировавшимися без фактора TGFβ3. Компрессионные свойства и модуль сдвига для суставного хряща, сформированного в присутствии фактора TGFβ3, не отличались от показателей естественного суставного хряща и были значительно выше по сравнению с хрящами, сформированными без фактора TGFβ3. Регенерировавший хрящ был бессосудистым и интегрированным с регенерировавшей субхондральной костью, обладавшей хорошо выраженными кровеносными сосудами. Доставка TGFβ3 увеличила количество клеток в регенерировавшем суставном хряще примерно на 130% по сравнению со спонтанной миграцией клеток без TGFβ3.

Объяснение: Можно предположить, что артикулярная поверхность синовиального сустава способна восстановиться без трансплантации клеток. Регенерация сложных тканей возможна путем хоуминга эндогенных клеток, что подтверждено на примере многослойного бессосудистого хряща и васкуляризованной кости. Вопрос в целесообразности клеточного хоуминга как дополнительного либо альтернативного метода доставки клеток при регенерации тканей различной сложности требует дальнейшего изучения.

Ли, Цзюнь-Хи, и др. «Производство 3D-матриц на 3D-плоттерах и их характеристики». Chinese Science Bulletin 55.1 (2010): 94-98.

Спроектирована и методом быстрого прототипирования изготовлена тканеинженерная 3D-матрица. Матрица должна иметь трехмерную структуру с сообщающимися порами. С помощью 3D-плоттера получена матрица-скаффолд из поликапролактона (PCL) с сообщающимися порами и однородной пористостью для врастания клеток. Чтобы поддерживать объемную форму структуры под нагрузками в процессе имплантации, спроектирована система осциллирующих сопел, повышающая модуль упругости и предел текучести PCL-нити. Методами сканирующей электронной микроскопии, динамического механического анализа и нано-UTM проанализировано влияние геометрии пор, модуля объемного сжатия матрицы, предела текучести нити. Кроме того, рассмотрены реакции клеток на матрицах.

Тавассол, Франк, и др. «Ускоренная ангиогенная реакция ткани реципиента на матрицы из поли (L-лактида-со-гликолида) за счет стимуляции остеобластоподобными клетками». Tissue Engineering Part A 16.7 (2010): 2265-2279.

Введение: В идеальном варианте заменители костей должны способствовать быстрой васкуляризации, которую можно ускорить, стимулируя эти заменители аутогенными клетками. Ранее уже приводились данные по приживлению пористых матриц-скаффолдов из поли (L-лактида-со-гликолида) (PLGA), но пока мало информации о том, как на васкуляризацию влияет подпитка матриц из PLGA, точнее, заселение их остеобластоподобными клетками (OLC). Для оценки ангиогенных и воспалительных реакций на имплантацию матрицы из PLGA, заселенной изогенными клетками OLC, проведено исследование in vivo.

Материалы и методы: Клетки OLC высаживали на покрытые коллагеном матрицы из PLGA, имплантированные в спинные кожные складки мышей BALB/c (n = 8). Еще две группы животных получили матрицы из PLGA с коллагеновым покрытием (n = 8) и без (n = 8). Контрольной группой выступали складки животных без имплантатов (n = 8). Через 14 дней методами прижизненной флуоресцентной микроскопии проанализированы развитие кровеносных сосудов, васкуляризация и взаимодействие лейкоцитов с эндотелиальными клетками.

Результаты: Матрицы из PLGA с клетками OLC и без них демонстрировали временное увеличение числа лейкоцитов. На третий день после имплантации в непосредственной близости от всех обследованных матриц наблюдалась выраженная ангиогенная реакция ткани реципиента. На 6 и 10 день в матрицах из PLGA, получивших клетки OLC, ангиогенный ответ был существенно выше (p < 0,05), чем в матрицах PLGA без покрытия и с коллагеном. При этом основная часть клеток OLC погибла в течение 14 дней после имплантации.

Заключение: Показано, что заселение матриц из PLGA клетками OLC ускоряет ангиогенную реакцию в окружающих тканях реципиента. Создаваемые методами тканевой инженерии заменители костей могут стать более качественным вариантом по сравнению с вариантами без заселения, хотя высаживаемые клетки живут относительно недолго.

Йилгор, Пинар, и др. «Влияние конструкции матриц и доставки BMP-2/BMP-7 на регенерацию костей in vitro». Journal of Materials Science: Materials in Medicine 21.11 (2010): 2999-3008.

Разработаны тканеинженерные 3D-конструкции, имитирующие условия in vivo за счет автономной системы доставки фактора роста. В матрицы из поли(ε-капролактона) с различной архитектурой, полученные по технологиям 3D-построения и мокрого формования, добавлены наночастицы для доставки факторов BMP-2 и BMP-7. Схема доставки: каждый фактор отдельно, одновременно и последовательно. Ориентация волокон не оказала значительного влияния на кинетику выделения белка BSA, но повлияла на пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Пролиферация клеток на матрицах с неупорядоченной структурой значительно выше по сравнению с четко ориентированными. При доставке исключительно фактора BMP-2 подавлялась пролиферация мезенхимальных стромальных клеток (MSC), активность ALP была выше, чем при доставке фактора BMP-7. Скорость пролиферации была наиболее низкой при последовательной доставке двух факторов роста из матрицы с неупорядоченной структурой волокон; при этом активность ALP была наиболее высокой. Результаты свидетельствуют о прямом влиянии конструкции матриц и режима доставки факторов роста на пролиферацию и остеогенную дифференцировку клеток MSC, что позволяет создавать многофункциональные матрицы, способные контролировать процесс излечения кости.

Банобре-Лопез, M., и др. «Магнитные матрицы на основе поли (капролактона) в инженерии костных тканей». Journal of Applied Physics 109.7 (2011): 07B313.

Комбинирование синтетических тканеинженерных матриц со стволовыми клетками представляет собой перспективный способ улучшить регенерацию обширных дефектов и повреждений тканей и органов. Методом послойного формирования на 3D-биоплоттере получены прототипы магнитных нанокомпозитов из биодеградируемого поли(капролактона) (PCL) и наночастиц гидроксиапатита, легированных суперпарамагнитным железом (FeHA) — в разных комбинациях PCL/FeHA. Для калибровки модели и технологической обработки при прототипировании намагниченных матриц использовались магнитные замеры, механическое тестирование и визуализация. Добавление магнитных наночастиц FeHA с массовой долей 10% делало PCL-матрицу прочнее, однако наблюдалось сокращение деформации при разрыве. Для готовых магнитных матриц выполнены замеры потерь энергии (абсорбции) в условиях радиочастотного магнитного поля. Полученные показатели нагревания делают эти конструкции весьма многообещающими в потенциальных задачах биомедицины.

Беттахалли, Н. М. С., и др. «Интеграция мембран из пустотелого волокна улучшает доставку питательных веществ в трехмерные тканевые конструкции». Acta Biomaterialia 7.9 (2011): 3312-3324.

Подача питательных веществ и кислорода в достаточном количестве — важный фактор пролиферации клеток в тканеинженерных конструкциях in vitro. Недостаток кислорода и среды культивирования создает потенциально летальные условия, снижает метаболическую активность и рост клеток. Диффузия через матрицы и мультиклеточную ткань обычно ограничивает возможность доставки in vitro, что чревато потенциальными гипоксическими областями и снижением толщины жизнеспособной ткани. Для получения соответствующих требованиям медицины тканеинженерных трансплантатов in vitro необходимо решить текущие проблемы с диффузией питательных веществ. Основные подходы к устранению проблем: культивирование в биореакторах, матрицы с искусственной микроциркуляторной частью, носители кислорода, предварительная васкуляризация искусственных тканей. Разработана и использована новая перфузионная система культивирования, обеспечивающая доставку клеткам в крупных трехмерных (3D) матрицах нужного количества питательных веществ. Предложена перфузия насыщенной кислородом культивируемой среды через пористое пустотелое волокно (HF), которое интегрируют в 3D-матрицы, полученные методом послойного формирования по компьютерным моделям. Моделью служили пре-миобластные клетки (C2C12) мышей, культивируемые на матрицах из блочного сополимера поли(этилен-оксид-терефталат)–поли(бутилен-терефталат) (300PEOT55PBT45) с пористыми HF-мембранами из модифицированного поли(эфир-сульфона) (компания mPES, Gambro GmbH). Оптимизирован ряд параметров: транспортировка по волокну, расстояние между волокнами в матрице, условия перемещения жидкости. Результаты показывают, что четыре мембраны HF в составе матрицы существенно улучшают плотность и распределение клеток. Получена основа для разработки новой методологии перфузионного HF-культивирования, которая позволит обойти ограничения в подаче питательных веществ клеткам в крупных 3D-матрицах из живой ткани.

Коуту, Даниэль, и др. «Иерархическая структура матриц в генной терапии гемофилии В с использованием мезенхимальных стволовых клеток». Biomaterials 32.1 (2011): 295-305.

Доклинические и первые клинические испытания генной терапии в лечении гемофилии В и других наследственных состояний дефицита белков плазмы показали весьма перспективные результаты. Однако для клинического внедрения генной терапии необходимо решить проблемы с безопасной доставкой вирусных векторов in vivo и недостаточной выживаемостью после трансплантации модифицированных клеток ex vivo. Рассмотрена 3D матрица-скаффолд из пористых композитов гидроксиапатита и PLGA с покрытием из биоминерализованного коллагена 1. При имплантации мышам с гемофилией матриц, дополненных аутогенным генноинженерным фактором IX (hFIX) и позитивными мезенхимальными стволовыми клетками (MSC), они длительное время поддерживали приживление трансплантата и системную доставку белков клетками MSC in vivo. Оптимизация матриц на макро-, микро- и наноуровне обеспечивает достаточную эффективность доставки клеток, самовозобновление клеток MSC и остеогенезиса, соответственно, при стабильной доставке hFIX. Вывод: генно-улучшенные матрицы, засеянные клетками MSC, могут иметь практическое значение в лечении гемофилии B и других состояний дефицита белков плазмы.

Де Сантис, Р. и др. «Базовый подход к разработке нанокомпозитных магнитных матриц в передовых технологиях инженерии костных тканей». Journal of Applied Polymer Science 122.6 (2011): 3599-3605.

По технологии трехмерной укладки волокна (3DF) разработаны и получены магнитные конструкции для тканевой инженерии костей на основе матрицы-скаффолда из поли(ε-капролактона) (PCL) и магнитных наночастиц оксида железа (Fe3O4). Массовая доля композитов в матрицах PCL/Fe3O4 составляла 90/10. Замерены удлинение и магнитные параметры; получены 3D-изображения методами недеструктивной микрокомпьютерной томографии (Micro-CT). Проведен конфокальный анализ сцепления и распространения мезенхимальных стволовых клеток человека на нанокомпозитных волокнах PCL/Fe3O4. Подтверждено, что наночастицы повышают механическую прочность PCL-матрицы. Модуль упругости и наибольшее напряжение выросли примерно на 10% и 30%, соответственно. При этом наибольшее удлинение сократилось почти на 50%, что свидетельствует о повышении хрупкости. Магнитные показатели подтвердили суперпарамагнитное поведение матриц из нанокомпозитов. Методы Micro-CT показали практически однородное распределение наночастиц. Конфокальный анализ продемонстрировал интересные результаты закрепления и распространения клеток. Полученные данные подтверждают, что полимерному матриксу для изготовления скаффолдов можно придавать магнитные свойства. Это станет следующим шагом в тканевой инженерии костей, откроет новые возможности для фиксации матриц-скаффолдов и расширения их функциональности.

Фейто, Мариа Хосе, и др. «Оценка иммобилизации и биоактивности FGF-1 и FGF-2 на порошковом кремнийзамещенном гидроксиапатите и полученных из него матрицах для тканевой инженерии костей». Journal of Materials Science: Materials in Medicine 22.2 (2011): 405-416.

Факторы роста фибробластов (FGF) представляют собой полипептиды, контролирующие пролиферацию и дифференцировку клеток различного типа, включая остеобласты. Факторы FGF выступают сильными стимуляторами ангиогенеза, необходимого для получения кислорода и питательных веществ в процессе восстановления ткани. Чтобы добавить актуальные биологические свойства FGF к биокерамическому материалу для восстановления костей, иммобилизацию биоактивных FGF-1 и FGF-2 провели на кремнийзамещенных гидроксиапатитах (Si-HA). Выполнена фиксация факторов роста на матрицах из порошкового Si-HA и матрицах-скаффолдах из Si-HA. После иммобилизации оба фактора сохранили биологическое воздействие на остеобласты. Улучшение сцепления и пролиферации клеток на матрицах Si-HA свидетельствует о потенциале матриц с факторами FGF в тканевой инженерии костей.

Гарсиа, Ана, и др. «Подготовка 3-D матриц в системе SiO2–P2O5 с заданной многоуровневой мезо/макропористостью». Acta biomaterialia 7.3 (2011): 1265-1273.

Впервые рассмотрен синтез трехмерных матриц-скаффолдов в бинарной системе SiO2–P2O5 с различными уровнями пористости: (i) четко упорядоченные мезопоры диаметром около 4 нм; (ii) макропоры диаметром 30–80 мкм с сообщающимися каналами около 2–4 и 8–9 мкм; (iii) сверхбольшие макропоры диаметром порядка 400 мкм. Благодаря многоуровневой пористости, полученные матрицы подходят для задач тканевой инженерии костей. Химический состав и мезопористость полученных матриц позволяют им выступать локальным средством контролируемой доставки биологически активных молекул, включая лекарственные средства, для лечения костных паталогий. Синтетический метод заключается в комбинировании одноэтапного золь-гель процесса в присутствии ПАВ как направляющего агента для мезоструктуры и биомакромолекулярного полимера (например, метилцеллюлозы) как шаблона макроструктуры для быстрого прототипирования. Для получения многоуровневой мезо/макропористости подробно исследованы процессы старения и реологические свойства гидросмеси после добавления метилцеллюлозы. Установлен временной период после подготовки состава, в течение которого гидросмесь по вязкости подходит для экструзии в системах быстрого прототипирования. При промышленном производстве матриц для восстановления и регенерации костных тканей большое значение приобретает отладка производственного процесса на лабораторном уровне.

Каммерер, М., и др. «Высвобождение вальпроата из поликапролактоновых имплантатов, изготовленных на 3D-биоплоттерах». Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences 66.7 (2011): 511-516.

Рассмотрена кинетика высвобождения вальпроата из поликапролактоновых (PCL) имплантатов, предназначенных для локальной антиэпилептической терапии. Имплантаты из PCL получены по оригинальной технологии 3D-Bioplotting. Кинетика высвобождения определялась суперфузией имплантатов. Вальпроат замерялся во фракциях для суперфузии методом жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Замеры HPLC линейны при концентрации вальпроата в диапазоне 10–500 г/мл; ограничение квантификации составило 9 г/мл. Выбранный метод HPLC является простым, точным и чувствительным. За первый день имплантаты из вальпроата (массовая доля 10%)-PCL высвободили почти 77% от максимально возможного объема. Для имплантатов (5%)-PCL показатель составил только 53%. После четырех дней из имплантатов (10%)-PCL высвобождено 88% вальпроата, из имплантатов (5%)-PCL — 94%. При растирании вальпроата в порошок перед обработкой на 3D-биоплоттере в первый день из имплантатов (10%)-PCL высвобождено только 63%. Высвобождение растертого вальпроата было существенно ниже по сравнению с вариантом для имплантатов (10%)-PCL без растирания. После трех дней суперфузии имплантаты выделили в общей сложности 89% растертого вальпроата; 88% через четыре дня для нерастертого вальпроата. После тестирования эпилептического фокуса на животной модели имплантаты из PCL с быстрым высвобождением можно использовать для изучения острых эффектов локального воздействия вальпроата на эпилептогенезис in vivo. Возможен анализ соответствующей биосовместимости.

Мейхер, Пауль С., и др. «Термографический анализ биологических 3D-матриц из агарозы». International Journal of Medical Engineering and Informatics 3.2 (2011): 167-179.

Благодаря разработкам в сфере быстрого прототипирования, конструкции из биосовместимых материалов (гидрогелей) теперь доступны для регенеративной медицины. Проблемы здесь связаны с механической нестабильностью таких материалов, которые чувствительны к температурам. Описаны результаты термографического анализа, призванного предотвращать блокирование игл при построении структур на биоплоттере. Эту технологию быстрого прототипирования используют для экструдирования гидрогелей при высоких температурах. Экспериментальный биоматериал — агароза. Рассмотрены пути преодоления характерных проблем с помощью термографического анализа, что позволило с высокой точностью создавать биологические 3D-матрицы, соответствующие потребностям клеток in vitro при получении матриц-скаффолдов из искусственных тканей. Путем изоляции иглы и камеры сокращено время нагрева иглы биоплоттера до рабочей температуры. Анализ позволил создавать биологические 3D-матрицы, соответствующие потребностям клеток in vitro при получении матриц-скаффолдов из искусственных тканей. Рассмотренный анализ дает возможность уже сейчас получать биологические 3D-матрицы из чувствительных к температурам гидрогелей.

Манзано, Мигуэль, и др. «Сравнение остеобластной активности на кремнийзамещенных гидроксиапатитных матрицах с различными остеостатиновыми покрытиями». Acta Biomaterialia 7.10 (2011): 3555-3562.

Синтезируемый паращитовидной железой белок (107-111) (остеостатин) стимулирует остеогенные эффекты в остеобластах in vitro и в регенерации костей у мышей и кроликов. На примере культур остеобластных клеток MC3T3-E1 оценивалась и сравнивалась биоактивность данного пептида, который адсорбировался либо ковалентно связывался через С-конец с матрицами из кремнийзамещенного гидроксиапатита (Si-HA) после органической (–NH2) функционализации. Предложенным способом можно высвобождать остеостатин локально либо закреплять его на поверхности матрицы. Это подтверждено химическим анализом и тестированием эффективности насыщенных остеостатином матриц Si-HA (помещенных в камеры системы Трансвелл) при зарастании царапин в мультипотентных мезенхимальных клетках мыши C3H10T1/2. Показано, что нанесение клеточных монослоев MC3T3-E1 на матрицы Si-HA с двумя типами остеостатинового покрытия (с доставкой и иммобилизацией) в одинаковой степени стимулирует рост клеток и минерализацию матрикса по сравнению с образцами без пептида. Следовательно, высвобождение остеостатина из матриц Si-HA не является обязательным условием стимулирования роста остеобластов и функционирования in vitro, что позволяет считать остеостатин фактором регенерации костей.

Шульман, Пауль, и др. «Сравнительное ускорение васкуляризации путем предварительного включения фрагментов аорты и мезенхимальных стволовых клеток в имплантируемые тканеинженерные конструкции». Journal of Biomedical Materials Research Part A 97.4 (2011): 383-394.

Острая потребность в замене поврежденных тканей породила множество подходов к получению разных видов тканей. Общей проблемой, осложняющей использование тканеинженерных конструкций в клиниках, остается их ограниченная васкуляризация. Для ускорения васкуляризации тканеинженерных конструкций сравнивалось использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (bmMSC) и фрагментов, полученных из аорты in vivo. Тканеинженерные конструкции из PLGA-матриц с Матригелем (n = 8), фрагментами внедренной в Матригель аорты (n = 8), внедренными в Матригель клетками bmMSC (n = 8) и фрагментами аорты, внедренными в Матригель вместе с клетками bmMSC (n = 8), импланировали в спинные кожные складки мышей линии balb/c и последовательно анализировали в течение 14 дней. Во всех группах кратковременно наблюдался слабый воспалительный ответ. Васкуляризация проходила существенно (p = 0,05) быстрее для структур, содержащих не только Матригель, но и клетки bmMSC, а также фрагменты аорты, что подтверждалось повышением плотности капилляров в течение всего эксперимента. Комбинирование клеток bmMSC с фрагментами аорты не оказало дополнительного влияния по сравнению со структурами, где были только клетки bmMSC либо фрагменты аорты. Улучшение васкуляризации и плотности капилляров для тканеинженерных конструкций сопоставимо для клеток bmMSC и фрагментов аорты. Фрагменты аорты представляют собой новый перспективный источник материала для клинически актуальных тканеинженерных конструкций.

Собрал, Йорге М., и др. «Полученные методом трехмерного построения матрицы с заданным, плавно меняющимся размером пор: влияние конструкции матрицы на механические свойства и эффективность посадки клеток». Acta Biomaterialia 73 (2011): 1009-1018.

Полученные по технологиям быстрого прототипирования (Rapid Prototyping, RP) матрицы-скаффолды подтвердили свою актуальность в тканевой инженерии — благодаря возможности получать заданные формы и структуры с полностью сообщающейся системой пор. Пока серьезными ограничениями к применению таких матриц остаются низкая эффективность посадки клеток и неравномерное их распределение. Основная причина — неподходящая структура пор в матрицах, полученных методами быстрого прототипирования, а также ограниченная эффективность стандартных методик заселения клетками. Целью работы было получение матриц с плавно меняющимся размеров пор, призванных способствовать повышению эффективности посадки и контролю пространственного размещения клеток в матрице. Разработаны и получены методом трехмерного построения матрицы на базе смеси крахмала и поли(ε-капролактона) с одинаковыми порами (размерами 0,75 и 0,1 мм), а также порами плавно меняющихся размеров (0,1–0,75–0,1 и 0,75–0,1–0,75 мм). Механические свойства матриц оценивались методами динамического механического анализа (ДМА) и традиционным испытанием на сжатие в присутствии влаги с последующим анализом методами сканирующей электронной микроскопии и микрокомпьютерной томографии. Чтобы проверить эффективность посадки и возможность контролировать зональное распределение клеток в процессе посадки, на матрицы высадили остеобластоподобные клетки. Сначала изготовили матрицы с плавно меняющимися размерами пор (градиентными). По механическим и морфологическим свойствам они занимали промежуточное положение между матрицами с одинаковым размером пор. Для матриц с градиентными порами эффективность посадки выросла на 35% и более в гомогенных матрицах до 70% в статичных условиях культивирования. Флуоресцентные изображения поперечных срезов матриц показали, что при порах плавно меняющегося размера клетки в матрице распределены равномернее.

Шин, Карен Б., Эммануэла Макридакис, Рамиль Н. Шах. «Трехмерная печать матриц из соевого белка в регенерации тканей». Tissue Engineering Part C: Methods 19.6 (2012): 417-426.

Важную роль в регенерации тканей играют трехмерные (3D) пористые матрицы-скаффолды с контролируемой структурой и геометрией. На текущий момент недостаточно исследована печать 3D-матриц из природных белков. На 3D-биоплоттере успешно отпечатаны матрицы из суспензии соевого белка. Разработан метод проверки целостности структуры матриц в процессе печати. Метод заключается в замере скорости подачи экструдируемой суспензии из устройства, которая напрямую зависит от давления в экструдере и свойств соевой суспензии. Оптимальная скорость подачи соевой суспензии для печати составляла 0,0072±0,0002 г/с при 27°C. Добавление к соевой смеси дитиотреитола продемонстрировало важность дисульфидных мостиков для формирования прочных структур при печати. Полученные на биоплоттере матрицы из соевого белка отвердили, используя 95% этанол. Дополнительная обработка включала дегидротермическую обработку (DHT), комбинацию лиофилизации и DHT, либо химическое сшивание с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC). Поверхностная морфология групп с разной обработкой оценивалась методами сканирующей электронной микроскопии. Свойства матриц, включая относительную плотность поперечных связей, потерю массы при промывании и модуль объемного сжатия, показали, что поперечно-сшитые матрицы из EDC прочнее всего при модуле порядка 4 кПа. Геометрия матриц (поворот слоев на 45° и 90°) влияла на механические свойства сшитых матриц из DHT и EDC. Эффективность посадки мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSC) была наиболее высокой для матриц без обработки и с термообработкой. Все матрицы длительно поддерживали жизнеспособность клеток hMSC.

Даоуд, Джамал, и др. «Диэлектрическая спектроскопия в неинвазивном наблюдении за дифференцировкой эпителиальных клеток в трехмерных матрицах». Physics in Medicine and Biology 57.16 (2012): 5097.

Представлена клеточная модель дифференцировки клеток на базе диэлектрической спектроскопии, описывающая процессы дифференцировки эпителия. Неинвазивное наблюдение за клетками реализовано в пространственной микросреде, состоящей из насыщенного клетками гелеобразного коллагена I, заселенного на микроматрицы. Для проверки концепции использованы почечные клетки собаки Madin-Darby, культивируемые в микроматрицах заданной формы, что позволило добиться дифференцировки полых цистоподобных структур. Трансформация в трехмерной среде при культивировании клеток in vitro отслежена и описана методами диэлектрической спектроскопии.

Глория, А., и др. «Трехмерные биоактивные матрицы из поли (ε-капролактона) с контролируемыми поверхностными и структурными свойствами». Biomacromolecules 13.11 (2012): 3510-3521.

До сих пор не удовлетворена потребность тканевой инженерии в многофункциональных матрицах-скаффолдах, где регулируемые структурные свойства скомбинированы с биоактивной поверхностью. Рассмотрены трехмерные (3D) биодеградируемые полимерные (PCL) матрицы с управляемыми макро-, микро- и наномеханическими свойствами, морфологией и поверхностными биоактивными компонентами (пептиды RGD). Для получения такой структуры технологию быстрого прототипирования (в данном случае 3D-укладку волокна) объединили с поверхностной обработкой (аминолиз с последующим сцеплением пептидов). Продуманное моделирование условий процесса позволило управлять механическими и биологическими свойствами структуры, регулируя модуль объемного сжатия (от 60 до 90 МПа, в зависимости от способа формирования структуры). Поверхностная обработка не влияла на макромеханическое поведение готовых матриц: объемные свойства остались прежними, но жесткость упала с 0,50–0,27 ГПа до 0,1–0,03 ГПа. Глубина химической обработки замерена методами конфокальной микроскопии и наноотпечатков. Эффективность функционализации и последующей биоактивации отслеживалась путем аналитической квантификации функциональных групп и/или пептидов на поверхности. Исследование адгезии фибробласта NIH3T3 показало улучшенное сцепление клеток, свидетельствуя об актуальности наличия пептидов. Основное внимание уделено влиянию поверхностной модификации на механические и функциональные свойства матриц. Также рассмотрены морфологический и аналитический подходы к изучению методов обработки для функционализации/биоактивации, распределения иммобилизованных лигандов и биологических параметров.

2013-2014

Месегур Олмо, Луи, и др. «Свойства матриц из Si-гидроксиапатита/поликапролактона/DMB, полученных по технологии 3D-печати». Journal of Biomedical Materials Research Part A 101.7 (2013): 2038-2048.

Методом быстрого прототипирования (3D-печати) изготовлены матрицы-скаффолды из поликапролактона и нанокристаллического кремнийзамещенного гидроксиапатита. Чтобы оценить соответствие матриц требованиям, предъявляемым к костным трансплантатам, их имплантировали новозеландским кроликам. Гистологические и радиологические исследования показали прекрасную остеоинтеграцию имплантированных в кость матриц без вставки волоконной ткани между костью и имплантатом и без иммунной реакции спустя 4 месяца после имплантации. Рассмотрена возможность повышения эффективности матриц путем внедрения деминерализованного костного матрикса при подготовке к 3D-печати. Внедрение деминерализованного костного матрикса (DBM) повышает эффективность матриц: через 4 месяца после имплантации формирование новой кости идет не только на периферийных участках матрицы, но и в порах. Улучшение результатов объясняется остеопроводящими свойствами DBM в матрицах, которые оценивались через формирование новой костной ткани при эктопической имплантации матриц.

Оливейра, А. Л., и др. «Периферийная минерализация биодеградируемой трубчатой 3D-структуры как способ дополнительной стабилизации направления при восстановлении после травм спинного мозга». Journal of Materials Science: Materials in Medicine 23.11 (2012): 2821-2830.

Из-за своей сложности травмы спинного мозга (ТСМ) представляют серьезную проблему для терапии. Очень перспективные результаты здесь демонстрируют комбинаторные подходы с применением биодеградируемых полимеров, которые одновременно служат тканеинженерной матрицей-скаффолдом, средством доставки клеток и резервуаром для стабильной подачи лекарственных средств. В предыдущих исследованиях разработана оригинальная гибридная система для регенерации в местах травм спинного мозга: по технологии быстрого прототипирования изготавливается полужесткая трубчатая пористая структура из крахмала/поли-е-капролактона (SPCL), концентрическая сердцевина заполняется гидрогелем из геллановой смолы. Данный проект должен привлечь внимание к улучшению остеоинтеграции в системах такого типа за счет выборочной предварительной минерализации внешних поверхностей трубчатых структур из SPCL методами биомиметики, когда в качестве зародышевого агента выступает гель с силикатом натрия. Задача — создать две разные клеточные среды, которые будут стимулировать аксональную регенерацию внутри конструкций, сохраняя при этом остеогенную активность на внешнем слое. Изолировав внутреннюю часть матрицы с помощью тефлонового цилиндра, удалось наблюдать формирование костеподобного слоя слабо кристаллизовавшегося карбонатапатита, который был однородным только на внешней части трубчатой структуры. Биомиметический слой поддерживал адгезию мезенхимальных стволовых ячеек костного мозга, которые за первые часы культивирования завершили реорганизацию цитоскелета в отличие от клеток, культивируемых на матрицах без покрытия. Подход может оказаться перспективным для локального стимулирования регенерации костной ткани и раннего вростания кости.

Сильва, Нуно А., и др. «Взаимодействие шванновских и обкладочных глиальных клеток с матрицей из крахмала/поликапролактона в лечении травм спинного мозга». Journal of Biomedical Materials Research Part A 100.2 (2012): 470-476.

Травмы спинного мозга (ТСМ) представляют собой серьезную проблему мирового здравоохранения. Налицо острая необходимость в оперативной разработке оригинальных подходов к ее решению. Ранее демонстрировалось, что имплантация матриц-скаффолдов на основе крахмала (SPCL) улучшает моторные функции при стабилизации спинного мозга у животных с ТСМ. Выдвинута гипотеза, что комбинирование таких матриц с соответствующими культурами клеток даст дополнительный прогресс в лечении ТСМ. Исследована и описана способность матриц из SPCL поддерживать 3D-культуру обкладочных глиальных клеток (OEC) и шванновских клеток (SC). Впервые показано, что матрицы из SPCL поддерживают рост и миграцию клеток OEC и SC. Установлено, что оптимальный срок для выхода на большое количество трансплантабельных клеток составляет две недели культивирования in vitro. В перспективе внимание будет уделено стабилизации состояния животных с ТСМ и регенерации повреждений с помощью SPCL-матриц с клетками OEC и SC.

Сан, Янг, и др. «Получение разлагаемых аморфных матриц с улучшенными механическими свойствами и равномерным распределением клеток методом трехмерной укладки волокна». Journal of Biomedical Materials Research Part A 100.10 (2012): 2739-2749.

Технология 3D-укладки волокна (3DF) значительно улучшила механические свойства аморфных, разлагаемых структур с высоким уровнем пористости из поли(лактида-ко-капролактона). Два типа матриц 3DF — с поворотом слоев на 45° и 90° — отпечатаны и сопоставлены с матрицами, полученными методом выщелачивания соли. Пористость матриц составила от 64% до 82% при высокой сообщаемости, замеренной методом микрокомпьютерной томографии. Компрессионная жесткость матриц 3DF была в 8–9 раз выше, а устойчивость к деформации в 3–5 раз выше по сравнению с матрицами, полученными выщелачиванием. В процессе печати зафиксировано выраженное снижение молекулярной массы под воздействием высоких температур. При этом микроструктура цепи сохранилась; температура стеклования и температура разложения были постоянными. Культура остеобластоподобных клеток человека in vitro, морфология и распределение клеток оценивались методами сканирующей электронной микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Распределение ячеек на матрицах 3DF было однороднее, чем на выщелоченных матрицах: соответственно, матрицы 3DF лучше подходят в качестве пористых биоматериалов для тканевой инженерии. Результаты демонстрируют потенциал разработки и оптимизации свойств аморфных полимерных матриц. Технология 3DF дает аморфные разлагаемые структуры из поли(лактида-ко-капролактона), которые достаточно прочны и хорошо подходят для пролиферации клеток.

Тёлль, Фолк Йоханнес, Мартин Фабритиус, Рольф Мюльхаупт. «Не содержащие эмульсификатора дисперсии с высоким содержанием графена для печатной электроники и графеновых пленок». Advanced Functional Materials 22.6 (2012): 1136-1144.

Представлен оригинальный, гибкий синтетический метод получения функциональных дисперсий графена в воде, ацетоне, изопропаноле (IPA) — долго сохраняющих стабильность и простых для воспроизведения. Для получения функционального графена (с массовой долей кислорода в пределах 4–16%) и собственно дисперсии используют металлотермию оксида графита с последующей гомогенизацией под высоким давлением. Впервые для получения разведенных и сильно концентрированных дисперсий из отдельных листов графена (содержанием графена до 15 г/л) не требуются связующие, диспергаторы, восстановители. Высокое содержание графена важно для успешной печати дисперсиями графена по технологии 3D-микроэкструзии. Предложенным методом успешно получают отдельные графеновые пленки и материалы на основе графена с микротекстурами. Благодаря отсутствию токсичных восстановителей, графен не проявляет цитотоксичности и является биосовместимым. В отсутствие связующих существенно возрастает токопроводимость графена. На различных материалах можно печатать гибкие, механически стабильные микрочипы, которые складываются в несколько раз без ущерба для проводимости.

Амороза, Л. Ф., и др. «Устойчивость к физиологическим нагрузкам аутотрансплантатов, аллотрансплантатов и матриц на полимерной основе при обширных сегментальных дефектах длинных костей: экспериментальное исследование». International Journal of Nanomedicine 8 (2013): 1637.

Введение. В рамках решения проблем лечения обширных интерполированных дефектов выдвинута гипотеза, что при цикличных физиологических нагрузках аутотрансплантаты, аллотрансплантаты и полимерные матрицы-скаффолды с мезенхимальными стволовыми клетками человека (hMSC) и без имеют разные биомеханические характеристики.

Методы. Взята за основу модель с дефектом бедра у крыс: 46 животных разбиты на четыре группы: аутотрансплантат (n = 12), аллотрансплантат (n = 10), матрица (n = 13), полимерная матрица с клетками hMSC (n = 11). В группах с матрицами использован 5 мм сегмент конструкции: 80% поли-ε-капролактон, 20% гидроксиапатит. Через 4 месяца после операции крыс умертвили, оценив восстановление методами радиографии и биомеханики.

Результаты. Наибольшее количество смычек в виде костных мозолей была в группах с аутотрансплантатами и аллотрансплантатами. В группе с матрицами и клетками hMSC костных мозолей было больше, чем в группе с чистыми матрицами. Признаки радиографического восстановления не совсем точно отображали восстановление механических свойств, но добавление к матрице клеток hMSC улучшило формирование костей. В группе с чистыми матрицами упругость и вязкостная жесткость были значительно ниже, а фазовые углы — выше по сравнению с другими группами и контралатеральными контрольными особями. Добавление клеток hMSC повышает упругость и вязкостную жесткость восстанавливающегося участка, одновременно снижая фазовый угол.

Заключение: Для оптимизации клинического применения матриц и клеток hMSC в лечении обширных дефектов необходим дальнейший сравнительный анализ. Добавление к матрицам клеток hMSC предположительно улучшает механическую стимуляцию нативной кости реципиента.

Ангарано, Марко, и др. «Послойно сформированные градиентные нетканые материалы из сшитых in sutu коллагеновых нановолокон, полученных электростатическим формованием (ЭСФ), в качестве модульных матриц для регенерации мягких тканей». Advanced Functional Materials 23.26 (2013): 3277-3285.

В многоцелевой модульной матрице-скаффолде градиентные нетканые материалы из сшитых in sutu желатиновых нановолокон (CGN), полученных электростатическим формованием (ЭСФ), ламинируются пористыми слоями и неткаными материалами из термопластичных несшитых биодеградируемых полимеров. Добавление глиоксаля к желатиновому раствору в нетоксичной сольвентной смеси из уксусной кислоты, этилацетата и воды (массовая доля 5:3:2) инициирует сшивание желатиновых нановолокон in situ при электростатическом формовании. Образование поперечных связей без флуорина снимает необходимость в пост-обработке сшиванием и очистке — этапах, характерных для традиционных матриц из CGN. Медленное образование поперечных связей в растворе желатина в присутствии глиоксаля повышает вязкость желатинового раствора для ЭСФ. Соответственно, средний диаметр сшитых желатиновых волокон постепенно увеличивается с 90 до 680 нм. При последующем ламинировании чередующиеся слои нетканых волокон CGN и поликапролактона (PCL), полученные 3D микроэкструзией микрометровых волокон PCL, сцепляются при нагревании до температуры выше точки плавления PCL. В отличие от водорастворимых желатиновых нановолокон и относительно непрочных волокон CGN, послойно сформированные биокомпозиты CGN/PCL/CGN устойчивы к воде и очень прочны. Прочность, скорость биодеградации и биологические функции модульных матриц контролируют варьированием типа, состава, диаметра волокон, пористости количества и последовательности нанесения слоев. Из многослойных биокомпозитов CGN/PCL можно получить матрицу любой формы и закрепить ее на ткани хирургическими швами с учетом особенностей конкретного пациента.

Беттахалли, Н. М. С., и др. «Волнистые круглые волокна улучшают сцепление и пролиферацию клеток в тканеинженерных матрицах». Acta Biomaterialia 9.6 (2013): 6928-6935.

Оптимальное взаимодействие клеток с матрицами из биоматериалов — важное условие для успешного получения тканей in vitro методами тканевой инженерии. Быстрое, эффективное и равномерное сцепление клеток повышает клинический потенциал искусственных тканей. Сейчас для создания матриц активно применяют технологии послойного формирования трехмерных (3-D) объектов. Методом укладки полимерных волокон получают матрицы с разной пористостью, пространственной архитектурой и механическими свойствами. Готовые матрицы состоят преимущественно из твердых круглых волокон. Выдвинута гипотеза, что волнистая морфология волокон улучшит закрепление и пролиферацию клеток, а следовательно, повысит успешность тканеинженерных конструкций in vitro. Путем экструзии блочного сополимера поли(этилен оксид терефталат)-co-поли(бутилен терфталат) (300PEOT55PBT45) через специально спроектированную силиконовую волнистую вставку получены круглые волокна с волнистой поверхностью. Круглые волокна с 6 и 10 желобками на поверхности сравнили с гладкими круглыми волокнами разного диаметра. На всех волокнах изучена культура премиобластных клеток мыши (C2C12) в статических и динамических условиях методами сканирующей электронной микроскопии, маркировки клеток и количественного анализа ДНК. После 7 дней культивирования в статичных условиях содержание ДНК на круглых волокнах с волнистой поверхностью было примерно в два раза выше, чем на гладких круглых волокнах. При культивировании в динамических условиях клетки на круглых волокнах с волнистой поверхностью испытывали вдвое меньшие механические нагрузки, поэтому закреплялись лучше, чем на гладких круглых волокнах. Результаты показывают, что поверхностная структура волокон в тканеинженерных матрицах может стать инструментом повышения их эффективности через улучшение адгезии и пролиферации клеток.

Шин, Карен Б., и др. «Острая и гуморальная реакция in vivo на трехмерные пористые матрицы из соевого белка». Acta Biomaterialia 9.11 (2013): 8983-8990.

Учитывая рост интереса к соевым биоматериалам в тканевой инженерии, исследована биосовместимость соевых имплантатов in vivo. Биосовместимость матриц-скаффолдов из соевого белка, изготовленных по технологиям лиофильной сушки и 3-D печати оценивалась с помощью подкожного имплантата на мышах линии BALB/c. Основные цели исследования: (1) сравнить протеин сои с бычьим коллагеном, хорошо известным натуральным белковым материалом для имплантатов, путем имплантации матриц с одинаковой белковой массой, и (2) оценить взаимосвязь между микроструктурой соевой матрицы и количеством белка, также влияющим на способность к деградации, и острыми и гуморальными реакциями на сою. Показано, что соевые матрицы после лиофильной сушки полностью распадаются через 14 дней. Коллагеновые матрицы (с той же протеиновой массой) оставались целыми 56 дней. Окраска трихромом по Массону подтвердила практически полное отсутствие повреждений и фиброза в области соевого имплантата. Матрицы с более высоким содержанием белка еще присутствовали через 56 дней. Окрашивание H&E показало, что инфильтрация макрофагов в более плотных соевых биоматрицах проходила сложнее, замедляя распад. Анализ специфических для сои антител в иммунной сыворотке мыши после имплантации дал повышенный уровень IgG1, коррелировавший с более высокой массой матрицы и плотностью протеина. При этом специфических для сои IgE не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии аллергической реакции на соевые имплантаты. Подтверждено, что соевый блок может выступать биосовместимым имплантатом в регенерации тканей; пористость матрицы, скорость ее распада и плотность соевого белка существенно влияют на острый и гуморальный иммунный ответ.

Чун, Еун Цз, Адам Э. Якус, Рамиль Н. Шах. «Формирование мембранных структур in situ из коллагена–гиалуроновой кислоты: механизм самосборки и применение в регенеративной медицине». Acta Biomaterialia 9.2 (2013): 5153-5161.

Биоактивные материалы для формирования in situ способны дополнить методы минимально инвазивного хирургического вмешательства и способствовать восстановлению тканей. Чтобы применять эти материалы в клиниках, необходимо сделать их доступными по цене и простыми в работе для хирурга, обеспечить подтвержденную биосовместимость. Представлен оригинальный и легко реализуемый подход к созданию мембран и инкапсулирующих структур из коллагена и гиалуроновой кислоты (HA). В отличие от мембран, послойно формируемых путем наложения биомолекул с противоположными зарядами, описанные мембраны коллаген–HA создают диффузионный барьер через электростатическое взаимодействие биомолекул с противоположными зарядами, дополнительно усиливая его колебаниями осматического давления. Полученные мембраны имеют нановолоконную архитектуру, толщину 130 мкм и модуль прочности (0,59 ± 0,06 МПа), который можно увеличить в 7 раз с помощью карбодиимида (4,42 ± 1,46 МПа). Мембраны коллаген–HA поддерживают пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток, медленно и равномерно высвобождая белок (7% к 28-му дню), что способствует направленной регенерации тканей. Продемонстрированы инкапсуляция клеток путем инжектирования кислоты HA в раствор коллагена, улучшение биосовместимости аллотрансплантата и имплантата путем нанесения покрытий. Описан оригинальный механизм формирования мембраны коллаген–HA, проведена подготовительная работа по использованию таких мембран в различных задачах тканевой инженерии.

Хендрикс, Дж. А. А., и др. «Влияние способности матриц удерживать клетки и их физико-химические свойств на регенерацию хрящей». Biomaterials 34.17 (2013): 4259-4265.

Один из основных принципов разработки матриц для регенеративной медицины заключается в имитации динамических механических свойств заменяемых ими тканей. Это необходимо для облегчения реабилитации пациента и восстановления привычной активности. Кроме того, важно определить влияние формирующейся ткани на механические свойства матрицы-скаффолда, чтобы оптимизировать структуру сообщающихся пор. В зависимости от биоматериала и технологии производства матрицы, достижение характерных для суставного хряща механических свойств может негативно сказаться на пористости матрицы, что замедлит формирование ткани. Показано, что матрицы с сообщающимися порами контролируемого объема, соответствующие по динамическим механическим свойствам суставному хрящу, эффективно поддерживают регенерацию тканей путем сокультивирования стандартных и увеличенных хондроцитов (1:4). Клетки культивировались на матрицах in vitro в течение 4 недель. После 28 дней на матрицах с нужными механическими свойствами (M) объем специфического хрящевого матрикса (ECM) был больше. Адгезионная композиция с более низким содержанием протеина поддерживала округлую морфологию хондроцитов, способствуя хрящевой дифференцировке. Интересно, что динамическая жесткость конструкций с нужными характеристиками после развития культуры осталась почти на том же уровне, свидетельствуя о сопоставимой кинетике формируемых тканей и деградации матрицы. Регенерация хряща в матрицах с нужными характеристиками подтверждена поверхностно in vivo. Очевидно, что матрицы с нужными механическими характеристиками и физико-химическими свойствами стимулируют дифференцировку хондроцитов.

Хигуэра Сьерра, Г. А., и др. «Сканирование in vivo внеклеточных компонентов матрикса, полученных в различных экспериментальных условиях при имплантации в одно животное». Integrative biology 2013.6 (2013): 889-898.

Эксперименты на животных способствуют прогрессу и повышают безопасность инновационных методик лечения, разрабатываемых лекарств и химических составов. К сожалению, они также связаны с рядом проблем этического характера, высокими затратами и количественными ограничениями в исследованиях. Предложено решить эти проблемы путем прямой имплантации в позвоночных животных ячеистых систем. С помощью технологии быстрого прототипирования создана трехмерная (3D) ячеистая система из биоматериалов для применения in vivo и in vitro. Сначала с учетом пространственной клеточной культуры и требований к сканированию молекул in vitro отрегулировали размер и количество ячеек. Функциональность ячеек оценили in vivo при 36 условиях регенерации тканей, включая мезенхимальные стволовые клетки человека hMSC и бычьи базовые хондроциты (bPCs), исследованные на одном животном. Каждая биосовместимая ячейка содержала заданное количество ткани (в мкл), что привело к интеграции с тканью реципиента и формированию ткани в условиях имплантации. Физическими и биологическими методами замерено количество внеклеточных компонентов матрикса (ECM) в каждой ячейке. Новая концепция сокультивирования клеток hMSC и bPC дала позитивные результаты в восстановлении хрящевой ткани, сопоставимые с традиционными методиками. Сканирование состояния кандидата in vivo открывает принципиально новые возможности для экспериментов, существенно сокращая потребность в подопытных животных и повышая скорость разработки новых методов лечения.

Хури, Пинар Йилгор, и др. «Доставка биомиметического фактора роста для улучшенной регенерации при дефектах подвздошного гребня». Biomedical Materials 8.4 (2013): 045009.

Давно доказана важность для тканевой инженерии факторов роста. Их доставка позволяет контролировать поведение заселенных в конструкции клеток и выполняется несколькими способами. В естественных условиях в восстановлении дефектов тканей участвуют разные факторы роста, которые достигают пиковой концентрации не всегда одновременно. Одной из последних методик стала комбинированная доставка факторов роста, имитирующая по дозе и частоте естественные циклы регенерации. Представлена in vitro последовательная доставка костных морфогенетических протеинов BMP-2 и BMP-7, появляющихся на самых ранних и поздних этапах регенерации костей, призванная улучшить остеобластную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Изучена эффективность данной стратегии доставки на примере подвздошного гребня кролика. В изготовленные на 3D-плоттере матрицы из поли(ε-капролактона) вносили наночастицы с фактором BMP, добиваясь: (а) отдельной доставки BMP-2 и BMP-7, (b) их совмещенной доставки одновременно или (c) последовательно (биомиметика). Через восемь недель после трансплантации результаты компьютерной томографии и биомеханического тестирования подтвердили, что при последовательной доставке формирование минерализованного матрикса и связь кости с имплантатом в месте дефекта были лучше, чем при отдельной либо одновременной доставке. Показатели минеральной плотности кости (МПК) и усилия выталкивания: 33,65 ± 2,25 г/см3 и 14,5 ± 2,28 МПа, соответственно, что почти в 2,5 раза выше по сравнению с матрицами без факторов (BМПК: 14,14 ± 1,21 г/см3 и 6,59 ± 0,65 Мпа). Подтверждены выводы, полученные in vitro; особо подчеркивается важность имитации естественных циклов биодоступности остеогенных факторов для улучшения регенерации при серьезных дефектах костей.

Изадифар, Зохрех, Лорой Дин Чапман, Сюнбяо Чэнь. «Компьютерная томография с использованием двухкристальных спектрометров с источниками синхротронного излучения для получения изображений имплантированных в хрящ тканевых матриц in sutu». Tissue Engineering Part C: Methods 20.2 (2013): 140-148.

Длительные исследования in vivo на животных с переходом к человеку должны опираться на неинвазивные наблюдения. Перспективным неинвазивным методом визуализации природных и/или искусственных тканей, а также биомикроструктур с нужным уровнем детализации in situ показал себя метод фаза-контрастной съемки с использованием двухкристальных спектрометров (DEI) с источниками синхротронного излучения (SR). Исследован метод SR-DEI в визуализации и анализе in situ тканеинженерных матриц, имплантированных в хрящ. Методом компьютерной томографии (CT)-SR-DEI при мощности рентгеновского излучения 40 кеВ получено изображение сустава коленной чашки поросенка с имплантированной матрицей из поли-ɛ-капролактона. Для сравнения визуализацию in situ также провели распространенными методами фаза-контрастной съемки SR CT и клинической магнитно-резонансной томографии. На снимках CT-DEI структурные свойства имплантированной матрицы представлены намного четче, чем на снимках CT-PC и MR. На снимках CT-DEI также визуализированы микроструктуры хряща и окружающие сустав мягкие ткани. На снимках, полученных другими способами, микроструктуры не просматривались. Очевидно, что технология CT-DEI подходит для неинвазивной визуализации и анализа матриц в хрящах: это прогрессивный метод тканевой инженерии для отслеживания успешности восстановления хряща с помощью матриц.

Кампманн, Андреас, и др. «Аддитивный эффект мезенхимальных стволовых клеток и VEGF на васкуляризацию матриц из PLGA». Microvascular research 90 (2013): 71-79.

Для создания тканеинженерных конструкций широко применяют мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (bmMSC), способные дифференцировать в различные типы клеток костных тканей. До сих пор возможности их использования в тканеинженерных конструкциях оставались ограниченными. Клетки внутри таких конструкций после имплантации быстро погибают, поскольку формирование новых кровеносных сосудов и их интеграция с циркулярной системой реципиента занимают длительное время. Влияние клеток bmMSC, VEGF и их комбинации на ранние этапы васкуляризации исследовано на модели кожной складки мыши методами прижизненной флуоресцентной микроскопии.

Тканеинженерные конструкции представляли собой матрицы из поли d,l-лактида-co-гликолида (PLGA) с коллагеновым покрытием. Функциональные свойства добавлены путем нанесения фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) или заселения клетками bmMSC. Контрольной группой выступали PLGA-матрицы без клеток и фактора роста. В тканеинженерных конструкциях с функциональными свойствами и живыми клетками формирование микрососудов шло быстрее по сравнению с контрольной группой. Отличия в васкуляризации для матриц с VEGF и bmMSC были незначительными. На 14 день ускоренное развитие микрососудов в матрицах с VEGF и bmMSC стало еще очевиднее.

Сделан вывод, что клетки bmMSC хорошо подходят для задач тканевой инженерии костей, выступая ценным источником ангиогенных факторов роста и стимулируя дифференцировку в клетки тканей нужного типа. Динамический процесс васкуляризации, запускаемый производящими фактор роста клетками, можно стимулировать и стабилизировать добавлением сопутствующих факторов роста. Метод дает устойчивый ангиогенез, но необходимы методы повышения сопротивляемости клеток bmMSC гипоксии и улучшения их жизнеспособности до момента формирования в тканеинженерной конструкции полноценной кровеносной системы.

Ли, Чанг Хунь и др. «Отпечатанные 3D-способом мультифазовые матрицы для регенерации при сложных периодонтах». Tissue Engineering Part A (2013).

Поддерживающий зуб периодонт формирует комплекс с различными тканями, включая цементное вещество, периодонтальную связку (PDL) и альвеолярный отросток. Разработаны мультифазовые локальные микроматрицы для пространственно-временной доставки биоактивных лекарственных средств при комплексной регенерации периодонта. Методом трехмерной печати изготовлены цельные матрицы из поликапролактиона–гидроксилапатита (массовая доля 90:10%) с тремя фазами: микроканалы 100 мкм для фазы А (стык клеточного цемента и дентина), микроканалы 600 мкм для фазы В (PDL), микроканалы 300 мкм для фазы С (альвеолярный отросток). В фазах А, B и С локально доставлялись и постепенно высвобождались комбинантный человеческий амелогенин, фактор роста соединительной ткани и костный морфогенетический протеин-2, соответственно. Через 4 недели инкубации in vitro отдельно с клетками пульпы зуба стволовыми/предшественниками (DPSC), клетками PDL стволовыми/предшественниками (PDLSC) либо клетками альвеолярного отростка стволовыми/предшественниками (ABSC) сформированы четкие фенотипы тканей с насыщенными коллагеном I волокнами, особенно для клеток PDLSC, а также минерализованные ткани с клетками DPSC, PDLSC и ABSC. Заселенные клетками DPSC мультифазовые матрицы после имплантации in vivo дали упорядоченные по аналогии с PDL коллагеновые волокна, внедрившиеся в сиалопротеин-позитивную костеподобную ткань, и будущие ткани матрикс цемента протеин 1-позитивный/ сиалофосфопротеин дентина-позитивный дентин/цемент. Результаты иллюстрируют стратегию регенерации мультифазовых периодонтальных тканей путем пространственно-временной доставки различных белков. Под воздействием биофизических свойств матрицы и локально выделяемых биоактивных веществ одна популяция стволовых клеток / клеток-предшественников дифференцирует в будущий комплекс из дентина/клеточного цемента, периодонтальной связки и альвеолярного отростка.

Нандакумар, Анандкумар, и др. «Комбинированные технологии создания биоактивных гибридных матриц в тканевой инженерии костей». Biomatter 3.2 (2013).

Перспективным подходом в тканевой инженерии и регенеративной медицине являются комбинированные технологии создания матриц с актуальными для клеток физическими и химическими свойствами. Комбинированием технологий быстрого прототипирования (RP), электроформования (ESP) и биомиметического покрытия изготовлены гибридные полимер-керамические матрицы для регенерации костей, призванные обеспечить одновременно механическую опору и физико-химическую среду, имитирующую органические и неорганические фазы костного внеклеточного матрикса (ECM). В качестве материала для трехмерных матриц выбран блочный сополимер поли(этилен оксид терефталата) - поли(бутилен терефталата) (PEOT/PBT). Технологии — 3D укладка волокна (3DF) и электроформование (ESP). Полученные конструкции покрыли слоем Ca-P, имитируя физиологическое решение. Морфология и состав матриц проанализированы методами сканирующей электронной микроскопии (SEM), энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX) и ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR). В течение 21 дня мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (mMSC) культивировали на матрицах 3DF и 3DF+ESP с покрытием и без в обычной и минерализованной среде. Оценивались сцепление и пролиферация клеток, экспрессия характерных для остеогенезиса генов. На всех матрицах клетки закрепились, делились и выделяли ECM. Существенных отличий в метаболической активности в группах на 7 и 21 день не зафиксировано. Для матриц 3DF с покрытием отмечено значительно более высокое количество ДНК в базовой среде на 21 день по сравнению с матрицами 3DF + ESP с покрытием. В минерализованной среде наличие покрытия на матрицах 3DF+ESP привело к резкому падению количества ДНК. Эффект от комбинирования различных материалов и технологий формирования матриц, влияющий на количество остеогенных маркеров (cbfa1, BMP-2, OP, OC и ON), подтверждает потенциальную важность такого подхода в тканевой инженерии костей.

Нандакумар, Анандкумар, и др. «Монолитные и сборные полимер-керамические композиты для регенерации костей». Acta Biomaterialia 9.3 (2013): 5708-5717.

Обоснование выбора полимер-керамических композитов в качестве основы для регенерации костей из природных компонентов кости, с коллагеном типа I и биологическим апатитом в качестве основных органических и неорганических компонентов, соответственно. Композитный материал PolyActive™(PA), сополимер поли(этилен оксид терефталата)/поли(бутилентерефталата) и гидроксиапатита (HA) с массовой долей 85:15, получен по технологии быстрого прототипирования двумя способами. В первом случае предварительно экструдированные композитные волокна PA–HA обрабатывали методом трехмерной укладки волокон 3DF (обычные композитные матрицы-скаффолды). Во втором случае матрицы-скаффолды PA изготовили по технологии 3DF и скомбинировали с опорами из HA в стереолитографических формах, помещавшихся в порах трехмерной структуры PA (сборные композитные матрицы). Анализ высвобождения кальция и фосфата в имитированном физиологическом решении, не содержащем кальция и фосфата, показал гораздо более высокие значения для опор HA по сравнению с другими матрицами. Выделение в имитированное тело насыщенной HA жидкости существенно не отличалось для разных матриц. На полимерных (3DF), обычных композитных (3DF-HA) и сборных композитных (HA в 3DF) матрицах культивировалась культура мезенхимальных стромальных клеток человека, которую методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени исследовали на морфологию, метаболическую активность, количество ДНК и экспрессию в генах остеогенных маркеров. Полученные методами сканирующей электронной микроскопии изображения подтвердили закрепление и проникновение клеток во все матрицы. Сборные композиты демонстрировали более высокую метаболическую активность по сравнению с матрицами 3DF-HA, но практически не отличались по количеству ДНК. Экспрессия генов остеопонтина в сборном композите была гораздо выше по сравнению с традиционными композитами. Получение композитов методом сборки представляется перспективной альтернативой традиционному изготовлению композитных матриц для регенерации костей.

Рагерт, Ким, и др. «Проектирование и терморегуляция новой дозирующей головки для микроэкструзии чувствительных к температурам термопластиков в 3D-плоттерах». Polymer Engineering & Science 53.2 (2013): 273-282.

Трехмерное построение объектов из микроэкструдированных волокон — перспективный метод производства пористых конструкций из термопластичных полимеров. Отмечено, что традиционные головки для микроэкструзии не подходят, поскольку не способны стабильно обрабатывать термочувствительные полимеры типа полимолочной кислоты (PLA): оставаясь в расплавленном состоянии до момента обработки, полимерная масса распадается под воздействием температуры, сокращается длина полимерных цепей. Разработана новая система дозирования, где зону подачи холодного материала термическим способом отделили от зоны экструзии, что позволило обрабатывать полимеры на основе PLA без повреждения их структуры. Рассмотрена конструкция новой дозирующей головки, сравнивается ее терморегуляция с характеристиками традиционной системы путем моделирования по методу конечных элементов и тепловидения.

Руссо, Тереза, и др. «Системный анализ инжектируемых материалов и магнитных матриц, полученных по технологии быстрого 3D прототипирования: от систем ЧПУ к восстановлению/регенерации мягких и твердых тканей». Procedia Engineering 59 (2013): 233-239.

В последние годы полимерные материалы привлекли интерес исследователей в сфере восстановления и регенерации тканей. Предложены различные системы инжектирования, нацеленные на сокращение инвазивности хирургии. В первой части проанализированы реологические и функциональные свойства инжектируемых материалов на базе гидрогелей, используемых в задачах центральной нервной системы и регенерации мягких тканей (полувзаимопроникающие полимерные сетки коллаген/PEG), а также инженерии твердых тканей (альгинат/легированный железом гидроксиапатит). Рассмотрена разработка матриц-скаффолдов из 3D нанокомпозита — поли(ɛ-капролактон)/легированный железом гидроксиапатит — в инженерии костных тканей; дана ориентировочная процедура оценки сил магнитного притяжения.

Замберг, Меган Е., и др. «Анализ биосовместимости активируемого электричеством серебросодержащего антибактериального поверхностного состава для медицинских приборов». Journal of Materials Science: Materials in Medicine 24.3 (2013): 755-760.

Затраты на дезинфекцию медицинских приборов и помещений являются серьезной проблемой для мировой системы здравоохранения. Для предотвращения передачи инфекций разработана профилактическая поверхность, длительно выделяющая ионы серебра с антибактериальными свойствами при активации электрическим током низкой интенсивности (LIDC; 28 μA системный ток при 6 В). Чтобы обеспечить безопасность при будущих исследованиях in vivo и в клиническом применении, рассмотрена биосовместимость LIDC-активируемой контактной поверхности с электродами серебра; токсичность in vitro для эпидермальных кератиноцитов, дермальных фибробластов и обычных остеобластов человека, а также антибактериальный эффект на примере Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Использование предложенной поверхности в медицинских приборах и хирургических инструментах, контактирующих с человеческими тканями в течение не более чем 1,5 ч., предполагает самостерилизацию без токсичных свойств in vivo.

Санчес-Сальчедо, Сандра, и др. «Разработка и получение биосовместимого цвиттер-ионного гидроксиапатита». Journal of Materials Chemistry B 1.11 (2013): 1595-1606.

Рассмотрены разработка и получение цвиттер-ионного нанокристаллического гидроксиапатита (HA), ингибирующего закрепление бактерий, но не препятствующего колонизации остеобластных клеток. Поверхностная функционализация порошковых составов HA проводилась методом пост-синтетической прививочной сополимеризации 3-аминопропилатриетоксисилана (APTES) и натриевой соли карбоксиэтилсиланэтриола (CES) в качестве аминовых и карбоксилатных предшественников, соответственно. Успешность функционализации поверхностей HA оценивалась методами элементарного химического анализа, замерами FTIR, 29Si, 31P и 13C твердотельных CP/MAS NMR, ζ-потенциала. Цвиттер-ионная природа синтезированного состава HA подтверждена наличием пар –NH3+/–COO− на поверхности материала. Для оценки состоятельности предложенной стратегии функционализации материала HA в различных физических формах методом быстрого прототипирования изготовлены макропористые 3D-матрицы HA с последующим наделением цвиттер-ионными свойствами. Способность материала HA противостоять адгезии бактерий при одновременном наличии на поверхности цвиттер-ионных пар –NH3+/–COO− HA протестирована на примере бактерии E. coli. Биосовместимость материалов in vitro изучена на культуре человеческих клеток HOS. Подтверждено, что процесс «цвиттер-ионизации» делает возможным получение материала HA в разных физических формах (частицы, гранулы, покрытия, плотные блоки, 3D-матрицы и пр.) с бактериальными антиадгезионными свойствами, без отрицательного влияния на биосовместимость. Выводы означают перспективы во многих клинических отраслях, включая стоматологию, челюстно-лицевую хирургию, отоларингологию, где менее активное закрепление бактерий на поверхности имплантата сокращает риск инфекции после хирургического вмешательства.

Сантис, Р. и др. «Высокотехнологичные композиты для инженерии твердых тканей на базе гибридных PCL/органических-неорганических наполнителей: от разработки плоских 2D-материалов к получению объемных 3D-матриц методами быстрого прототипирования». Polymer Composites 34.9 (2013): 1413-1417.

Известна биоактивность соль-гель синтезированного поли(ε-капролактона) (PCL)/TiO2 или частиц поли(ε-капролактона)/ZrO2. Ранее предлагалось разрабатывать оригинальные 2D-композиты для инженерии твердых тканей, добавляя в PCL-матрикс гибридные наполнители PCL/TiO2 и PCL/ZrO2. Продемонстрирован потенциал технологии 3D-укладки волокна в разработке матриц с контролируемой морфологией из материала PCL, усиленного гибридными наполнителями PCL/TiO2 и PCL/ZrO2. Сначала с помощью анализа 2D-материалов методом конечных элементов установлена взаимосвязь между полученными ранее результатами пенетрационного тестирования и модулем Юнга. Для матриц, полученных методом быстрого прототипирования, выполнены механические и биологические тесты, оценивающие влияние гибридных наполнителей на свойства пористых 3D-структур. Продемонстрирован положительный эффект гибридных наполнителей на модуль объемного сжатия (около 90 МПа) и жизнеспособность/пролиферацию клеток.

Шульман, Пауль, и др. «Ускорение раннего ангиогенеза в тканеинженерных конструкциях in vivo путем использования культуры стволовых клеток в Матригеле». Journal of Biomedical Materials Research Part A (2013).

Серьезной проблемой для исследований в сфере тканевой инженерии является получение конструкций, актуальных для клинических испытаний. Залогом их успешной приживаемости является быстрое врастание кровеносных сосудов в трансплантируемые тканеинженерные структуры. Чтобы ускорить развитие капилляров в искусственных тканях, перед трансплантацией в спинные кожные складки мышей линии balb/c проведена предварительная инкубация остеобластоподобных клеток, мезенхимальных стволовых клеток и их комбинации в наполненных Матригелем PLGA-матрицах. Предварительная инкубация остеобластоподобных клеток существенно ускорила ангиогенез. По сравнению с предыдущими исследованиями, показавшими видимый прирост васкуляризации на 6-й день после имплантации, удалось сократить этот период вдвое и добиться визуально более плотных капиллярных сетей в тканеинженерных конструкциях уже через 3 дня после трансплантации. По сравнению с более ранними исследованиями воспалительная реакция ткани реципиента была ниже, сохраняясь на приемлемом уровне. Соинкубация остеобластоподобных и стволовых клеток не оказала дополнительного влияния на плотность вновь сформированной капиллярной сети. Предварительная инкубация мезенхимальных стволовых клеток в Матригеле — перспективный подход к ускорению формирования капилляров в тканеинженерных конструкциях. После имплантации в организм реципиент в матрицах со стволовыми клетками быстро появляются капилляроподобные структуры. Следовательно, для трансплантированных стволовых клеток повышается вероятность дифференцировки в клетки кровеносных сосудов. Предварительная инкубация мезенхимальных стволовых клеток в питательных растворах, отвечающих различным стадиям ангиогенеза, — один из способов расширить клиническое применение тканевой инженерии.

Шрути, Шрути, и др. «Подготовка биоактивных мезопористых матриц из стекла с содержанием церия, галлия и цинка». Acta Biomaterialia 9.1 (2013): 4836-4844.

Комбинированием индуцированной испарением самосборки и технологий быстрого прототипирования синтезированы мезопористые биоактивные матрицы-скаффолды (MBG_Scs): 80% мезопористое золь-гель стекло SiO2–15% CaO–5% P2O5 (в мол. %) с замещением Ce2O3, Ga2O3 (оба по 0,2% или 1,0%) и ZnO (0,4% или 2,0%). Выбор микроэлементов церия, галлия и цинка обусловлен присущими им актуальными биологическими свойствами. Готовые матрицы проанализировали и сравнили с матрицей без замещения (B_Sc). Все матрицы характеризовались хорошо сообщающимися сверхбольшими порами (> 400 мкм), оптимально подходящими для врастания кровеносных сосудов и пролиферации клеток. Размер макропор внутри матриц составлял 100–400 мкм. Метод рентгеновской дифракции под малыми углами показал, что структурная мезопористость матриц B_Sc и матриц с замещением на 0,4% выше, что актуально для удержания биологически активных молекул. Структурные свойства B_Sc: удельная поверхность 398 м2/г, диаметр пор 4,3 нм, объем пор 0,43 см3/г. При замещении отмечено небольшое сокращение поверхностной площади без выраженного влияния на диаметр пор. Все матрицы MBG_Scs, кроме 2,0% ZnO_Sc, продемонстрировали быстрый биоактивный ответ in vitro. Работа стала полезным дополнением к текущим исследованиям по получению биокерамических тканеинженерных матриц с терапевтически важными элементами.

Ванг, Мин-Дан, и др. «Оригинальные сшитые гидрогели из альгината/гиалуроновой кислоты в инженерии нервных тканей». Frontiers of Materials Science 7.3 (2013): 269-284.

Искусственные тканеинженерные матрицы-скаффолды потенциально способны обеспечить опору и поддержку при отращивании пострадавших в результате повреждения нерва аксонов. Из альгината и гиалуроновой кислоты (HA) синтезирован гибридный биоматериал. Проанализированы совместимость с ковалентной модификацией, биосовместимость с живыми клетками Шванна, возможность применения в создании трехмерных (3D) матриц. Непрямое формирование амидов через карбодиимид с образованием ковалентных поперечных связей в HA шло в присутствии ионов кальция, участвовавших в сшивании альгината. Обнаружено, что образование амидов зависит от концентрации карбодиимида и хлорида кальция. Биосовместимость композитных гидрогелей с двойными поперечными связями сопоставима с простыми гидрогелями HA: они поддерживают жизнеспособность и рост клеток Шванна. Между композитными гидрогелями с различной массовой долей альгината и HA существенных отличий не выявлено. Для производства 3D-матриц использована система быстрого прототипирования 3D BioPlotter™. Показано, что комбинирование альгината и HA упростило процесс производства. 3D-матрицы с пористой внутренней структурой можно получать не только из HA, но и из композитных гидрогелей. Информация станет базой для последующего тестирования гидрогеля из альгината/гиалуроновой кислоты in vivo и in vitro в качестве биоматериала для создания матриц с живыми клетками, поддерживающими регенерацию нервных тканей.

Бакариш, Шеннон Е., и др. «Полученные методом печати смешанные ионно-ковалентные гидрогели из каррагенина и эпоксидного амина». RSC Advances 4.72 (2014): 38088-38092.

На 3D-принтере получены смешанные ионно-ковалентные гидрогели из каррагенина и эпоксидного амина. Чтобы зафиксировать нанесенный состав до образования ковалентной полимерной структуры путем включения эпоксидного амина, использовались свойства биополимера каппа–каррагенин в состоянии гелевого термоперехода. Расширение отпечатанного гидрогеля составляет 1,4 ± 0,3 МДж/м3.

Бакариш, Шеннон Е. «Трехмерная печать усиленных волокном композитов из гидрогеля». ACS Appl. Mater. Interfaces

По технологии аддитивного одноэтапного производства, комбинирующего цифровое моделирование и 3D-печать, подготовлены усиленные волокнами гидрогели. Композитные материалы получены на экструзионном принтере путем упорядоченного нанесения комбинированного раствора из альгинат/акриламид гелевого предшественника и УФ-отверждаемого адгезионного состава на эпоксидной основе (Emax 904 Gel-SC). С помощью УФ-излучения два состава объединены в композитный материал. Управляя через цифровые модели пространственным распределением волокон, удалось изготовить серию образцов с различными показателями разбухания и механическими свойствами. Физические параметры варьировались от мягких и влажных до сухих и твердых. Чтобы показать, что разбухшие композитные материалы укладываются в стандартную теорию композитов, проведено сравнение с «правилом смесей». Для иллюстрации потенциального применения в биоинженерии изготовлен прототип хрящевого мениска.

Билье, Томас, и др. «3D-печать тканеинженерных конструкций с высокой выживаемостью клеток из желатин-метилакриламида». Biomaterials 35.1 (2014): 49-62.

Рассмотрено комбинирование химии материалов, инженерии и биологии в рамках системного подхода к получению методом 3D-печати макропористых конструкций из желатин-метилакриламида с высокой выживаемостью клеток. Вместо традиционного состава 2959 предложено использовать и оптимизировать VA-086 в качестве фотоинициатора с улучшенной биосовместимостью. Выполнено параметрическое исследование печати желатином с анализом и сравнением архитектуры конструкций. Тщательно проанализирована зависимость между концентрацией строительных блоков в гидрогеле, температурой, давлением, скоростью печати и плотностью клеток. Возможно проектирование матриц с полностью (100%) сообщающейся сетью пор при массовой доле желатина в 10–20%. Рассмотрено производство заселенных клетками матриц-скаффолдов; протестировано соответствие требованиям тканевой инженерии путем инкапсуляции линии клеток злокачественной гепатомы (HepG2). Выявлена зависимость между выживаемостью клеток, давлением при печати и формой иглы. Подтверждена возможность печати механически устойчивых заселенных клетками матриц из желатин-метилакриламида с высокой выживаемостью клеток (>97%).

Даманик, Фебрийани ФР, и др. «К модели in vitro, имитирующей реакцию на инородное тело: корректировка поверхностных свойств биоматериалов для моделирования внеклеточного матрикса». Scientific reports 4 (2014).

Несмотря попытки свести к минимуму реакцию реципиента на имплантацию биоматериала, актуальным подходом для регенеративной медицины представляется использование ответа иммунной системы для запуска и управления процессом регенерации тканей. Разработана модель in vitro для моделирования реакции реципиента путем корректировки поверхностных свойств биоматериала через модификацию поверхности, что может стать новым словом в регенерации тканей. Подтверждена возможность варьировать поверхностную топологию, шероховатость, смачиваемость и химический состав путем изменения типа и длительности обработки. Впервые учтено влияние поверхностных свойств на закрепление, морфологию, прочность и пролиферацию клеток, провоспалительные (IL-1β, IL-6) и противовоспалительные цитокины (TGF-β1, IL-10), выделяемые в среде, а также экспрессию белков коллагена и эластина. Микроструктура поверхности, полученная частичным травлением хлороформом, повысила шероховатость и содержание кислорода. Это положительно сказалось на сцеплении клеток, их прочности и пролиферации, а также балансе растворимых факторов для оптимального синтеза коллагена и эластина при регенерации тканей. Путем привязки поверхностных параметров к активности клеток смоделировано состояние регенерируемой ткани для успешной замены мягкой тканеинженерной конструкцией.

Несифи, Сина, и др. «Дисперсии оксида графена: корректировка реологии для производственных задач». Materials Horizons 1.3 (2014): 326-331.

Продемонстрировано, что дисперсии оксида графена (GO) обладают уникальными вязкоупругими свойствами, что выделяет их в новый класс мягких материалов. Полученные выводы станут основой для создания методик производства конструкций из этих мягких плоских материалов по различных технологиям.

Нойфурт, Майк, и др. «Разработка морфогенетически активного гидрогеля для биопечати искусственных тканей, полученных из остеобластоподобных клеток человека SaOS-2». Biomaterials (2014).

Стабилизированный желатином гидрогель альгината натрия — биологически инертный матрикс, который подходит для инкапсуляции и 3D-биопечати костных клеток SaOS-2. При этом внедренные в такой матрикс клетки не поддерживают пролиферацию. Добавление к отпечатанной на биоплоттере матрице-скаффолду из альгината/желатина/клеток SaOS-2 наружного слоя из агарозы и кальциевой соли полифосфата [комплекс polyP·Ca2+-] привело к активной пролиферации клеток. В присутствии 100 мкм комплекса polyP·Ca2+- клетки делились в среднем каждые 47–55 ч. Жесткость гидрогеля из альгината/желатина дополнительно увеличивается в присутствии полимера. Пониженный модуль Юнга для гидрогеля с альгинатом/желатином составляет 13–14 кПа. После инкубации заселенной клетками матрицы в течение 5 дней величина падала до 0,5 кПа. В присутствии 100 мкм комплекса polyP·Ca2+- пониженный модуль Юнга восстанавливается примерно до 22 кПа. Жесткость комплекса polyP·Ca2+- с гидрогелем почти не меняется, если в матриксе отсутствуют клетки, но падает до 3,2 кПа после 5-дневного инкубационного периода при наличии клеток SaOS-2, что свидетельствует о метаболизации, переработке клетками комплекса polyP·Ca2+-. Система альгинат/желатин-агароза с комплексом polyP·Ca2+- резко повышает минерализацию клеток. Сканирующая электронная микроскопия показала, что морфология минеральных утолщений на поверхности клеток, внедренных в гидрогель из альгината/желатина, практически не отличается от показателей клеток в монослойных культурах. Разработанная методика, использующая клетки, инкапсулированные в гидрогель из альгината/желатина, и дополнительный слой с морфогенетически активным, стимулирующим рост полимерным комплексом polyP·Ca2+-, открывает новые возможности для 3D-биопечати в сфере тканевой инженерии костей.

Риз, Адам, и др. «3D-биопечать конструкций из карбоксиметилированной, окисленной периодатом наноцеллюлозы для получения повязок на раны». BioMed Research International

Определенные свойства наноцеллюлозы делают ее оптимальным вариантом для задач биомедицины, включая повязки на раны. Из этого прочного материала можно выпускать прозрачные пленки, которые обеспечат влажную среду, благоприятствующую заживлению ран, а также получать упругие гели с актуальными для биозадач характеристиками. Рассмотрено применение наноцеллюлозы в качестве биочернил, модифицирующих поверхность пленок при биопечати. Использовалось два разных типа наноцеллюлозы, подготовленных методом опосредованного окисления с использованием TEMPO, а также комбинацией карбоксиметилирования и окисления периодатом. Комбинация карбоксиметилирования и окисления периодатом дала гомогенный материал с короткими нановолокнами шириной < 20 нм и длиной < 200 нм. Малый размер нановолокон снизил вязкость наноцеллюлозы: по реологическим свойствам она соответствовала биочернилам. Для иллюстрации результатов чернилами из наноцеллюлозы отпечатали пористые 3D-структуры. Подтверждено еще одно интересное свойство новых материалов: оба вида наноцеллюлозы замедляют рост бактерий.

Ван, Сяохун, Хайнц С. Шредер, Вернер ЭГ Мюллер. «Универсальный неорганический полимер биокальцит: строительный блок для спикул известковых губок и клеточный материал для синтеза кости из фосфата кальция». Beilstein Journal of Nanotechnology 5.1 (2014): 610-621.

Карбонат кальция — материал, из которого состоят спикулы известковых губок. Недавние исследования показали, что спикулярный скелет таких животных из карбоната кальция/биокальцита формируется через ферментативные механизмы. Таков, например, скелет известковых губок, являющихся древнейшими живыми созданиями из биокварца. Отвечающий за осаждение карбоната кальция фермент называется карбоангидраза (CA): его клонировали из известковых губок рода Sycon raphanus. Отложения карбоната кальция также зафиксированы в позвоночных костях наряду с основной их составляющей, фосфатом кальция/гидроксиапатитом (HA). Есть свидетельства, что на начальной фазе синтеза HA появляется осадок в виде слабо кристаллизованного карбонизированного апатита. Собранные данные свидетельствуют, что на первых этапах формирования кости отложения карбоната кальция, сформированные под влиянием фермента CA, выступают потенциальным источником материала для осаждения минерала фосфата кальция на формирующие кость остеобласты. При анализе осажденного под влиянием ферментов карбоната кальция in vitro обнаружены две его модификации: кристаллы кальцита и круглые частицы фатерита. Фермент CA — новая цель потенциальных анаболических агентов для лечения заболеваний костей; уже определен первый активатор CA, стимулирующий осаждение карбоната кальция в присутствии CA. Формирование кристаллов карбоната кальция в присутствии CA можно заморозить на стадии фатерита, добавив силинтафин-2, богатый аспарагиновой и глутаминовой кислотами белок, характерный для губок. Тот факт, что кристаллы карбоната кальция способны играть роль биоматериала при формировании человеческих костей, может помочь в разработке оригинальных биомиметрических матриц для тканевой инженерии. Уже демонстрировалось, что обогащенные биокварцем натриево-альгинатные гидрогели — подходящий матрикс для костеобразующих клеток в биопечати методами быстрого прототипирования / клеточной 3D-печати.

Чжан, Цзяньхуа, и др. «Отпечатанные 3D-способом магнитные композитные матрицы Fe3O4/MBG/PCL с расширенной функциональностью: регенерация костей, локальная доставка противораковых лекарственных средств, гипертермия». Journal of Materials Chemistry B (2014).

Методом 3D-печати изготовлены трехмерные (3D) матрицы-скаффолды из мезопористого композита — биоактивное стекло/поликапролактон — с содержанием магнитных наночастиц Fe3O4 (Fe3O4/MBG/PCL). Систематически проанализированы их физиохимические свойства, биоактивность in vitro, доставка противораковых лекарственных средств, механическая прочность, чувствительность к нагреву магнитным полем и реакция клеток на матрицы Fe3O4/MBG/PCL. Подтверждены однородные микропоры размером 400 мкм, высокая пористость матриц Fe3O4/MBG/PCL на уровне 60% и отличное сопротивление сжатию в 13–16 МПа. Добавление в матрицы MBG/PCL магнитных наночастиц Fe3O4 не повлияло на минерализацию апатитов, но улучшило чувствительность к нагреву магнитным полем, а также существенно стимулировало пролиферацию, активность щелочной фосфатазы (ALP), экспрессию связанных с остеогенезисом генов (RUNX2, OCN, BSP, BMP-2 и Col-1), минерализацию внеклеточного матрикса для мезенхимальных стволовых клеток человеческого костного мозга (h-BMSCs). При использовании в качестве модели доксорубицина (DOX), противоракового лекарственного средства, матрицы Fe3O4/MBG/PCL поддерживали постепенное его высвобождение, соответствуя требованиям локальной доставки лекарственных средств в терапии. Отпечатанные 3D-способом матрицы Fe3O4/MBG/PCL продемонстрировали потенциальную многофункциональность: улучшенная остеогенная активность, локальная доставка противораковых лекарственных средств, магнитная гипертермия.

Чжан, Цзяньхуа, и др. «Трехмерная печать мезопористых матриц из биоактивного стекла с содержанием стронция для регенерации костей». Acta biomaterialia 10.5 (2014): 2269-2281.

Способом трехмерной (3D) печати изготовлены мезопористые матрицы заданной архитектуры с повышенной механической прочностью — из биоактивного стекла (Sr-MBG). В матрицах Sr-MBG зафиксированы однородные сообщающиеся макропоры при высоком уровне пористости. По сопротивлению сжатию они в 170 раз превышали MBG-матрицы из полиуретановой пены. Физикохимические и биологические свойства матриц Sr-MBG оценивались через растворение ионов, способность к формированию и пролиферации апатитов, активность щелочной фосфатазы, остеогенную экспрессию и минерализацию внеклеточного матрикса остеобластоподобных клеток MC3T3-E1. При увеличенном содержании Sr в матрицах Sr-MBG отмечено замедленное растворение ионов и более высокий потенциал к стабилизации pH среды. Важно, что матрицы Sr-MBG продемонстрировали хорошую способность к формированию апатитов, стимулировали пролиферацию и дифференцировку остеобластных клеток. На примере дексаметазона подтверждено, что благодаря мезопористой структуре матрицы Sr-MBG подходят для постепенного высвобождения лекарственных средств в локальной терапии. У отпечатанных 3-D способом матриц Sr-MBG есть потенциал в сфере регенерации костей: они комбинируют преимущества материала Sr-MBG с хорошими биоактивными костеобразующими свойствами, контролируемым высвобождением ионов, доставкой лекарственных средств и улучшенной механической прочностью. 

Перевод Олеси Зайцевой

Цифровое производство спинных имплантов

Аддитивное производство спинных имплантатов

Современные имплантаты, полученные методом лазерного плавления
Технология аддитивного лазерного плавления LaserCUSING в производстве спинных имплантатов-клеток объединяет достоинства традиционных титановых компонентов и материала PEEK и исключает их недостатки. Полученный методом лазерного плавления имплантат — это биосовместимость титана и эластичность пластика в одном изделии. Изготовленные по этой технологии спинные клетки могут иметь очень сложную форму и не требуют дополнительной обработки поверхности (рис. 1а, b и с). Технологическое решение: конструкция с неоднородной плотностью (внутренняя «паутинная» структура) придает титановым деталям характерную для пластика эластичность. При производстве методом лазерного плавления клетке легко придать нужную форму с учетом анатомических особенностей пациента — конечный продукт индивидуален. По словам Стефано Казелли, производство клеток методом лазерного плавления представляет собой настоящую инновацию: теперь в одном изделии объединены и нужные характеристики материала (в частности, биосовместимость, т. е. возможность вживлять материал в кость), и необходимая человеческому телу эластичность. С помощью компьютерной или магнитно-резонансной томографии хирург легко определит положение отдельных клеток. Технология лазерного плавления подходит для выпуска изделий по индивидуальному заказу и малыми партиями: это могут быть клетки «под заказ» для пациентов с анатомическими особенностями и типовые решения для остальных. Клиническое исследование, проведенное в марте 2014 г. в сотрудничестве с Университетом Ольденбурга им. Карла фон Осецкого (Германия), подтвердило отличные прогнозы излечения для данных имплантатов. 

См. полную версию материала о производстве спинных имплантов на оборудовании Concept Laser

В начало

Карта сайта